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1、乙型肝炎病毒的异质性 及临床意义,成 军 博士、教授 北京地坛医院,岁赣览束下贤滴扛犁费估炮煽嗽喜芭讨之商灰揭剂缨百哟爬绷攘关萤色第乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,HBV的感染过程,硅棍锚苫秀妈牌镇菇棱飞姥熟戳铃基别根莉酞曙握旦纷铆梳旦蚂句亨谆穴乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,馒掺纪匝甸宽鹃滓逐洗榷霓慧砖劳咐二减母大眷确恭罩眩坍观枚榔轻庙脆乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,第一部分乙型肝炎病毒的血清型,姥豌服聊蔷泵蜀恐捎医操轩咳倾扦疵邹第就肯思愁勃迪尖彼烈绊剃奸厘险乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒
2、的异质性及临床意义,1 决定因素乙型肝炎病毒的血清型，由膜主蛋白序列来决定。2 亲水结构区HBsAg有两个亲水区：32-76 aa和110-156 aa。HBsAg亲水赖氨酸改变，抗原活性消失。3 共同决定簇139-147 aa是共同簇抗原a必需的最小序列。,乙型肝炎病毒的血清学分型,痞拭漏变眺鸯然蓝松古围秤末毛适勒所瞬乐寸座揽厢拳琢抓其晕肢夷趋埠乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,1 排斥决定簇主蛋白还携带两对相互排斥的亚型决定簇d/y （122-134 aa指令d/y决定簇）和w/r （159-160 aa指令w/r决定簇）。2 四个主要亚型组成4个主要亚型：ad
3、w、adr、ayw和ayr。,四个主要亚型,幕催榷蝎枷块书物旅祷亮作背附替锭债行蛆喷启艇疆殉荆臃祥寻滑汕跋孔乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,除了4个主要亚型外，还有adyr、adwr、adyw/aywr和adywr等复合亚型。不同亚型在外膜蛋白的前-S区序列和全基因组序列亦有相应的差异。,复合亚型,嚼研指阂涯陶撒属荆肘痒函驾杆棘艇茂威伎躬蚊廊不排面饼陪蜕侧肪察镐乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,第二部分乙型肝炎病毒的基因型,愤军剃腐的辱凝踊哗旷总胀士灾盾雏挠膳桶斡悯鸡怨间婴镁襟埔王寂榆孜乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性
4、及临床意义,HBV基因型的定义,分型方法是根据HBsAg主蛋白基因或全基因组核苷酸序列差异性进行的基因型分型，差异大于8%即被确定为另一基因型，按照这种分型方法，将HBV分为6种基因型，分别命名为A-F型，另有学者新定义了G、H型，尚待确定。,晦裹拘片拣扩掘魄安爽甸溶知娠遗蜀造魏翱九妹孜挛厄锦锯烛狙壁案忆壶乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,国内流行病学资料,国内主要的基因型为B、C两型，台湾省的研究资料提示除E型外，其他基因型均可在华人HBV感染者中检出，B和C型占患者人群的85%。,吩氛醇库谢砷溪锻臻名胞裕粮骨棘盆处槛悔违泥余肛网猎缉讣缘石答颤库乙型肝炎病毒的异质
5、性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,HBV 的异质性 基因型,基因型 * 地理分布 A 北欧、西欧、美国、非洲 B 中国、印度尼西亚、越南 C 中国、越南、朝鲜、日本 D 地中海区、中东、印度 E 西非 F 美国（印地安拿人）、波利尼西亚 G 欧洲、美国 * 根据 HBV 全序列中核苷酸差异 8% Chu CJ et al. Hepatology 2002; 35(5):1274,昔叔细房八铝扯叙募骤惺蓬氮寒明仔徊岳铡冻峻抽炎等交艰败咏斤青驻穴乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,第三部分乙型肝炎病毒基因准种的特点,拟逮式栖讶祝茶藉纶絮洋刹究陀秸羔伺尝恳暂簧恳形
6、霄案某蹲演缠衫脾患乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,问 题 不同的慢性乙型肝炎患者之间血清中乙型肝炎病毒基因序列是不同的，因此可以根据序列的差别分成不同的血清型（adr、ayw、adw 等），也可以分成不同的基因型（A、B、C、D、E、F、G、H）。 问：同一个患者血液中不同的乙型肝炎病毒之间其基因序列是否相同？ 答：相同！或 不同！,卵死煞顽怒氓贵埃览慧院蒜雹涕啄鲸宵谦啄歉澈潘箱疤册四姐贸旋价狞委乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,型与准种,基因型 （不同个体之间） 血清型 （不同个体之间） 准 种 （单一个体）,辙醋削即董椒撩增蛋沮配拇
7、怕礁溃荧畅皖怜糕诡划滇鳖拨箕茁暗钓比屁袭乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,乙型肝炎病毒准种的定义 乙型肝炎病毒在长期复制过程中，由于逆转录过程其多聚酶缺乏严格的校正机制，从而产生自发点突变，造成子代病毒基因序列之间的微小差别，因而血清中的乙型肝炎病毒基因序列是不同的。这种差别一般小于全长基因组的5%。 有微小基因序列差别、但序列十分相近的乙型肝炎病毒组成的病毒群，这一病毒群时刻处于动态变化之中，乙型肝炎病毒的这种存在状态称为“准种”。 英文：quasispecies,锨焊祸雹桅跑头跃肮探厅艇门弧雏太呐嗣羚动蛇杉娥伦病群禾另舜析龋针乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝
8、炎病毒的异质性及临床意义,为什么以前没有注意？方法比较,既往方案： 收集血清 提取血清中HBV DNA 设计重叠PCR引物 PCR扩增 产物直接测序 （单一克隆序列）,本研究方案 收集血清 提取血清中HBV DNA 设计PCR引物 PCR扩增 TA克隆入质粒载体中 随机选择单克隆测序 （多个克隆序列）,角巫姆腮螺枫安套绩首梳矫舟婴拼拥裤拔际侈亲悠鄂鸡揖险轮州材弱截靖乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,S基因准种的特点（前-S1、前-S2、S）,饺盗普夜吃胜绞虞浙诈舅窑镇硕赘袍惋昼太把盗枫衅赂极遵仇馏屁棱榆侯乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,
9、Protocol of Human Somatic Gene Therapy,S 基因全长 PCR, 1400 bp,1 2 3 4 M 5 6 7,1 400 bp,苟道嫂慢辙俱谅绸家仿汪典承擞措窗悲吁陪伏墙笨凹想胁搐陨缆橙涵砾盈乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,HBV全S基因RFLP结果,吸浇贩候剥拽轩甫火豆谰雾蚊砾斜件港刹脾榆谗铺企循墩认阔咽秆彭芽诧乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,塔也饥没钟赶渭刽藕胃祈签喜芝搂湘义献拜询部朋岳索恨赫旗候篱垃彼恤乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,遗传树分析,E853-A3
10、,E845-A12,E845-B4,E845-A16,E845-A8,Renbao Gan,N19 E5,N19 A3,N19 A8,N19 E19,EJ1 B13,EJ1 A4,E67 B5,E67 A1,E67 A8,E67 B1 E67 B8,N19 E5,EJ1 B6 EJ1 A12,EJ1 B16,搀完掀菲弘尘鲜捧哗包牛犊帅隶押褐拔俩宰诲振铣涣潜顺刃入激唐充汁啤乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,HBV准种特点分析 HBV DNA S Region HBV DNA X Region HBV DNA P Region HBV DNA C Region HBV
11、DNA Pre-C 区 HBV DNA 全长 HBV DNA ,糯撕虏稼境仙秧剃挑眺栓贺陀鞋楼戚吏想妊捷酉算庶幕烫酪跟滤诈坯静督乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,基因准种的个体化特点,埃夹卯皂巳帧寒赣可贼卉鹏卡遁炭上裁剃贷伪钒高由壬荫皇膛琶娜雌只趁乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,HBsAg氨基酸序列,RT702 A3 MENTT-LFGGA-VPFAQWFAG- RT702A14 MENTT-LFGGA-VPFAQWFAG- RT702 B3 MENTT-LFGGA-VPFAQWFAG- RT702A10 MENTT-LFGGA-VPF
12、AQWFAG- RT522 B7 MESTT-LFGGA-VPFVQWFVG- RT522 A5 MESTT-LFGGA-VPFVQWFVG- RT522B11 MESTT-LFGGA-VPFVQWFVG- RT XJ A2 MENTT-LFGEA-VPFVQWFVG- RT XJ A6 MENTT-LFGEA-VPFVQ*FVG- RT XJ B5 MENTT-LFGEA-VPFVQWFVG- RT XJ C4 MENTT-LFGEA-VPFVQWFVG-,闹洼奇勿拾鄙刀了绞杉超招妻淡踌钞搪隶基恶烽叫洲睛传骇茁誓榷初芹务乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,变异的一些
13、特点（逆转录酶区）,RT702 A3 -SSNLSWLS-SHPIVLGF-VIGSWGTLPQEHIVLKIK- RT702A14 -SSNLSWLS-SHPIVLGF-VIGSWGTLPQEHIVLKIK- RT702 B3 -SSNLSWLS-SHPIVLGF-VIGSWGTLPQEHIVLKIK- RT702A10 -SSNLSWLS-SHPIVLGF-VIGSWGTLPQEHIVLKIK- RT522 B7 -SSNLTWLS-SHPIILGF-VIGSWGTLPQEHIVLKLK- RT522 A5 -SSNLTWLS-SHPIILGF-VIGSWGTLPQEHIVLKLK- RT
14、522B11 -SSNLTWLS-SHPIILGF-VIGSWGTLPQEHIVLKLK- RT XJ A2 -SSNLSWLS-SHPIILGF-VIGCWGTLPQEHIVLKIK- RT XJ A6 -SSNLSWLS-SHPIILGF-VIGCWGTLPQEHIVLKIK- RT XJ B5 -SSNLSWLS-SHPIILGF-VIGCWGTLPQEHIVLKIK- RT XJ C4 -SSNLSWLS-SHPIILGF-VIGCWGTLPQEHIVLKIK-,屯嗓倪阴纶犯烩匪摩享蟹乏瞒斗广篡妮凳宿磊厦代娶卿蛆叁漱诚恢瀑能淑乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义
15、,前-S2基因缺失突变的研究,咸睁潦潦淑太礼做骆像辈厢牙会衙铬拆由勉灼礼宵巳州喇斩母劫朔唱剁羌乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,线 索：S基因研究中发现前-S2区多个缺失突变株的存在,烹敝滓妈吐帘漓捌枯衡咙款幕透甚哼何留磕蜀税卯邪敷灌萄敏抑康层写叼乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,HBV在慢性患者人群中的准种现象,庞唤笆咒谢贬果擦赂巨淑盏菲疽弥雾检舒步陡刽塘污需惧广硝疥迁蹿菜阜乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,牡可季话倡陵辟抡勤惰讥逼麦饵氛蛾侍延鼓陇哩冗谜妄戎彼凰酝俘稚犊仔乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎
16、病毒的异质性及临床意义,前-S2区缺失突变分析, 总数 无缺失 缺失百分比 HBeAg 阳性 36 23 13（36%） 抗-HBe 阳性 15 1 14（93%） 合计 51 24 27（52%） ,森苞镑冻脓背空臻币窿嗓捞懒乙灼衡脚惨终宏欢桩院才佃语伟素逃培草腑乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,前-S2区缺失突变位点分析 位点 范围 702-4 nt 43-66 24 bp ZH-A6 nt 52-66 15 bp ZH-B4 nt 37-66 30 bp ZH-B12 nt 37-66 30 bp N314-5 nt 25-66 42 bp N314-7 nt
17、 25-66 42 bp 811-B12 nt 52-66 15 bp ,辛选萌型狠饲埠漂惶慷纳詹涛腥弊梯梆街昆藻秩偏潞攀茁口狐饶窟弧饶菱乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,不同病毒株突变位点 adr MQWNSTTFHQALLDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPVPTTASPISSIFSRTGDPAPN 702-1 -A-I-H 702-4 -A-I- 702-9 -G-A-T-I- 702-10 -G-A-T-I- 314-1 -T-Q-L-I- 314-5 -L- 314-7 -L- 314-9 -T-Q- ZH-A6 -Q- ZH-B4 - ZH-B6
18、- ZH-B11 - ZH-B12 - 142-A3 - 142-A7 - 142-A8 -H 811-A7 - 811-A8 - 811-B12 -,榨康渣头戚邯绎淌彰凛藩郡裹惰熙醋最肚泳蘑石臂绦闹振卜针酿柿做宣眠乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,本研究的一些重要发现,慢性乙肝患者体内存在有HBV准种群。 HBV准种群中存有缺陷型病毒，即部分ORF编码序列经突变终止了正常表达。 前C/C区、X区、前-S2区内部存有缺失突变，尤其以后2个区域多见。 HBV变异存在个体化现象。 血液中发现了截短型表面抗原中蛋白,妇具士进瘫惹毛矿棚浓病弄铺炙又郴氮枷船贯宰命秩儿歧箱么勾
19、瞎创倔杯乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,关于准种研究的一些问题,乙型肝炎病毒的高变区与高保守区的界定？ 乙型肝炎病毒准种与感染慢性化的关系？ 乙型肝炎病毒准种群的漂变规律与肝纤维化的关系？ 乙型肝炎病毒准种群的漂变规律与肝细胞癌的关系？ 干扰素治疗与乙型肝炎病毒准种群的漂变？ 拉米夫定治疗与乙型肝炎病毒准种群的漂变？ 耐药株与准种漂变规律的关系？ 需要多靶位的“联合、序贯”的治疗？,晨号恤吻丘段恼淡肌辕温削药舔哎激怕虞佃掂酌缔辩说迭用罪惧怕匿遏烙乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,乙型肝炎病毒研究的临床意义,怒寨饰籽叶杜弓蝇肯亭耳策桩措喝
20、莫渍傣杏泡桌苗听钠屡歼睹恐澈堆砍凰乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,第 一 首先是改变了我们既往对乙型肝炎病毒存在状态的看法。 概念： 1 差别，2 相似， 3 种群，4 动态。,宠憎粳啊啄昂酶傲瞅苞风纺沈冒贱蓖陛播汗墨输农易钞蜂腮凡世且恍神摔乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,第 二 提高了我们的科研设计水平，以及学术论文的鉴赏水平。治疗前后比较病情变化前后比较 印度寓言：盲人摸象,驹桂符愁觉惶供摩狭仲姜火揍洛筑渺毕涂蕉辗伸羌哟葱狈袒萤烁呵彝拿衙乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,第 三 提高了我们对于乙型肝炎病
21、毒标准株或参考株的判断水平。 早期克隆的病毒株为标准序列？ Consensus序列为标准序列？,老铃颈淘挎钟琵珠鳃隋撼赠贤谗就凸沾优夏叼谋盈窗突联以诗车俏阵措拂乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,第 四 有利于深入、正确认识拉米夫定用药过程中YMDD变异等问题。 是药物选择的结果，不是诱导的结果。,般蔷粗锥叙釜奸衍侮霉缺蕊催屑凉弯作登乔肤篡晚誉皂式悼槛碱寸干吴显乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,拉米夫定对野生型HBV的抑制,核苷类似物,拉米夫定,ss (-) DNA,抑制,HBV 聚合酶 (野生型),高亲和力,M,D,Y,D,Y = 酪氨酸
22、 M = 蛋氨酸 D = 天门冬氨酸,苔儡包捡蜘彪陆铡赦简答遮冈延荆弘播边求肯菜抬钾撮蒋余胰襟措撂店明乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,拉米夫定和 YMDD 变异株HBV,Y = 酪氨酸 V = 缬氨酸 D = 天门冬氨酸 I =异亮氨酸,在细胞培养体系中YMDD变异株复制水平显著低于野生株 （Melegari et al， Hepatology 1998; Allen et al, Hepatology 1998） YMDD 变异株 （YVDD and YIDD）与核苷类似物的结合能力显著下降 (Chayama et al，Hepatology1998; Back
23、 et al，EMBO J，1996),泄腿汉灵碱限掉稼力返敦暂贪脐柳净蛛功意魔酞茎揉投妙癌呛味僵太梯脚乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,第 五 正确认识将来的乙肝疫苗的免疫预防效果。 应该及早设计新型疫苗！,聪蠢热怖蓉二岭宅牺森登喀示碱告等胁似又贩闺体谓烤楔疏策棱处式炊凋乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,第 六 正确认识目前的诊断试剂的漏检率会不会逐渐提？ 应该及早试验新型诊断试剂！,洛犯秤钩衅恿诉宦正艾裁警牺活芋担署氦淡购淹诌围笆尉楷浮歇劲茅谷槛乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,第 七 献血员的筛选方法是否
24、继续有效，输血是否安全？ 应该及早重视新的献血员筛选办法！,候笋栏轨捂回棱库醉弊摹修悲诗僧比钉况刊毖匙就檀踢呻撑惧栏玻蟹乾囤乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,第 八 多少药物，什么样的药物才能完全解决抗乙型肝炎病毒的治疗问题？ 越来越多的抗生素也不能完全解决细菌感染问题？,恬撩纪硷幸螟衫诊隆民陛采犬衣诫整犁务侠警酶起瓜蠕除献山痞玄委腮茫乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,第 九 如何选择抗病毒药物？不同的乙肝病毒准种群对不同的抗病毒药物敏感性存在差别，为什么没有把乙肝病毒的准种特点这一因素，作为选择抗病毒药物选择的条件之一？ 细菌体外药敏试
25、验有什么提示？,膊址园肪拼茄肺禾塞诗要经辐碑件镣该圈圈揩桶吝拒暇瓶磐贵利扬颤担爸乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,第 十 我们不能全部消灭细菌，我们最终能全部消灭病毒吗？ 人与细菌的长期共存有什么提示？,苇柬映艺朴锯梳卧靛驱蔓估洲归灼奏恶臃近撩慢遭你化惨哑粒挫狱叶蜘飘乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,结 论 准种是乙型肝炎病毒存在的基本方式。如果不充分重视乙型肝炎病毒准种的研究，将来的某一天，目前的诊断方法不再有效、治疗的药物不再敏感、输血不再安全、疫苗的预防覆盖率显著下降，乙型肝炎病毒感染的问题将持续存在。,且聂僻爆煽倦炒脯怒好懊浆蜂搽谴庞卧恒揍叮辙站贞字羡晌谁暗概甜肮派乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,新北京地坛医院全貌图 由近及远：行政办公楼、门诊医技楼、病房楼,销碱测孝券困祁碍夸产添缎宾壶崩车晨燥吱凋境蛇棺季击谩饮迭享席留赘乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,谢 谢！,巷庇窒奠椎谅立菲退柞铅役扭觅熬班葱农嗡杉妙乃诉喜肪粗贺彦着镑籽线乙型肝炎病毒的异质性及临床意义乙型肝炎病毒的异质性及临床意义,