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1、环孢素眼植入凝胶膜制备及其体外释放探究 摘要：目的以交联透明质酸为载体制备环孢素眼植入凝胶膜，观察其体外药物释放特性。方法以酰肼为交联剂，将环孢素与透明质酸钠混合后反应形成载药凝胶膜；采用等距浸出法测定载药凝胶膜的体外释放度，绘制它在2种不同释放介质中的体外释放曲线，探讨透明质酸酶对其药物释放的影响。结果环孢素眼植入凝胶膜载药率为(2.900.14) (n5)；在等渗磷酸盐缓冲溶液中释放缓慢且恒定，28 d内药物释放符合零级动力学方程；在含有透明质酸酶的释放介质中，药物释放速度加快，并随凝胶中透明质酸的降解速度而变化。结论环孢素眼植入凝胶膜是一种有开发价值的眼植入缓释制剂。 关键词：环孢素；交
2、联透明质酸；眼植入剂；缓释 中图分类号：R988.1文献标识码：A文章编号：1672-979X(2008)11-0015-04 Preparation of Cyclosporin Hydrogel Film for Eye Implant and Study on Drug Release in vitro CHEN Jian-ying, LING Pei-xue, HE Yan-li*, LIU Jie, WANG Min (Institute of Biopharmaceuticals of Shandong Province, Jinan 250108, China) Abstract
3、：Objective To prepare cyclosporin hydrogel film for eye implant with cross-linked hyaluronic acid derivatives as vehicle, and evaluate drug release properties in vitro of the hydrogel film. Methods Cyclosporin and sodium hyaluronate were mixed to form hydrogel film with acid hydrazide as a cross-lin
4、king agent. The drug release rate of the hydrogel film in vitro was measured by equal distance release method. The release curves of the hydrogel film in two media were drawn, which could be used to evaluate the effect of hyaluronidase（HAse）on the release of cyclosporin. Results The drug loading of
5、the hydrogel film was (2.900.14) （n5）. The release of cyclosporin from the hydrogel film was slow and significantly sustained and the drugrelease pattern followed a zero-order kinetics equation in isotonic phosphate buffered solution during the first 28 d. The release rate of cyclosporin was increas
6、ed in the medium with HAse and it changed following the degradation rate of hyaluronate. Conclusion Cyclosporin hydrogel film made of cross-linked hyaluronic acid derivatives can be a worthwhile development as a sustained-release preparation for eye implant. Key words：cyclosporin; cross-linked hyalu
7、ronic acid; eye implant; sustained release 环孢素（cyclosporin）是一种选择性免疫抑制剂，目前临床常用于抗器官移植排斥反应。眼科使用环孢素滴眼剂主要用于治疗角膜移植排异反应、自身免疫性眼病以及干眼症1。文献报道，环孢素用于青光眼小梁手术还具有促进滤泡形成、抑制滤泡成纤维细胞增殖和过滤通道瘢痕化等作用2。在此类手术中，临床通常联合植入交联透明质酸凝胶，借助透明质酸凝胶的物理支撑、阻隔作用，达到提高手术成功率的目的3。 透明质酸（hyaluronic acid，HA）是由（1-4）D-葡糖醛酸和（1-3）N-乙酰基-D-氨基葡糖双糖单位重复连接组
8、成的链状聚阴离子黏多糖。由于HA具有良好的生物相容性和独特的理化性质，作为黏弹剂广泛用于眼科和骨科，同时作为药物载体用于多种药物制剂4。交联HA是HA的衍生物，它克服了天然HA在组织中易降解和扩散，体内存留时间较短等缺点，进一步扩大了HA在医药领域的应用5。实验证明酰肼交联HA凝胶对多种非水溶性药物有较好的缓释作用6。本实验首次采用酰肼交联HA作为缓释材料制备环孢素缓释制剂，并对其体外释放进行研究，为其作为用于青光眼滤过手术的辅助植入剂提供依据。 1材料与仪器 Waters 3596高效液相色谱仪（2996 PDA检测器）；AT261电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；JHT-XTC超净工
9、作台（济南洁康空气净化设备厂）；HZQ-2数显全温振荡器（金坛医疗仪器厂）。 发酵法生产的HA钠（sodum hyaluronate，SH）平均相对分子质量（Mr）为（1.01.9）106，山东福瑞达生物化工公司；环孢素（福建科瑞药业公司，批号：050402）；环孢素对照品（中国药品生物制品检定所，批号130495-200202）；乙基（N,N-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDCI）和己二酸二酰肼（ADH）（Aldrich Chemical Co.）；注射用玻璃酸酶（HAse，上海第一生化药业公司）。乙腈和甲醇为色谱纯试剂，其它均为分析纯试剂。 2方法和结果 2.1环孢素眼植入凝胶膜的制备 取S
10、H 0.2 g，加入Tris-HCl（0.5 molL-1，pH4.5）缓冲液8 mL溶解，加入ADH 35 mg，搅拌溶解，再加入环孢素细粉0.5 g，研匀；另取EDCI 48 mg溶解于2 mL Tris-HCl缓冲溶液（0.5 molL-1，pH 4.5）中，倒入上述混悬溶液，研匀，灌入事先固定的玻璃板之间缝隙中，水平放置于（250.5）反应8 h，反应结束后形成环孢素均匀分布的白色凝胶膜。 用等渗磷酸盐缓冲液（PBS，0.29 mmolL-1 NaH2PO4，1.56 mmolL-1 Na2HPO4和145 mmolL-1 NaCl，pH 7.2）将凝胶冲离玻璃板，用大量PBS浸泡纯化
11、5 h，得到体积微小膨胀的白色凝胶膜。 在超净工作台中，将凝胶膜平铺在洁净玻璃板上，用薄刀片切成高4.5 mm、底边分别为0.5 mm和3 mm的等腰梯形凝胶膜小片，然后分装于5 mL西林瓶中加盖，121 灭菌10 min，备用。 2.2环孢素眼植入凝胶膜载药量的测定 取0.5 g凝胶膜，加甲醇至5 mL，振摇提取15 min，静置10 min，采用高效液相色谱法（HPLC）测定上清液中环孢素含量。色谱条件：C18硅胶柱（5 m，4.6 mm250 mm），流动相0.1磷酸-甲醇（793），流速1.0 mLL-1，检测波长210 nm，柱温50 。按外标法以峰面积计算环孢素含量，计算环孢素凝胶
12、膜的平均载药量（环孢素质量/凝胶膜质量100 ）为（2.900.14）%（n5）。 2.3体外药物释放曲线的绘制 取凝胶膜0.5 g，置入自制尼龙网小袋（1 cm1.5 cm，200目），置于具塞试管底部。采用等距浸出法7，每个试管加入PBS 3 mL，置（352）恒温振荡器，转速60 r/min。固定时间取出全部释放液，加入等量同温度PBS。取释放液1 mL，加甲醇至5 mL，振摇1 min，10 000 r/min离心15 min。取上清用HPLC测定环孢素含量，计算累计释放量，并以时间为横坐标，绘制释放曲线，见图1。将环孢素的累积释放量与时间作线性回归，回归方程为Y = 0.256 8
13、X0.048 4（0.999 1，P0.05）。 2.4HAse对环孢素眼植入凝胶膜释药的影响 2.4.1环孢素的释放曲线按2.3的方法操作，将释放介质换为含300 UmL-1 HAse的PBS，绘制环孢素释放曲线，见图2。 2.4.2SH的释放曲线取凝胶膜0.5 g，加甲醇至5 mL，振摇提取15 min，静置10 min。弃上清，沉淀用5 mL无水乙醇冲洗3次，加入0.5 molL-1硫酸溶液10 mL，加热溶解，加水稀释至100 mL。取1 mL用改良咔唑显色法8测定糖醛酸含量，乘以2.07得SH含量为（1.480.06）%，（n5）。 另取2.4.1的释放液1 mL用3 mL乙醚提取6
14、次，每次提取2 min，10 000 r/min离心15 min。弃醚液，沸水浴加热水层溶液5 min，5 000 r/min离心15 min，取上清置入10 mL量瓶，加水至刻度。取1 mL作为供试液，同法测定糖醛酸含量，计算SH累计释放量，绘制释放曲线，见图2。 3讨论 3.1交联HA凝胶载体的特点 由于环孢素Mr较大，通透性差，局部滴眼用于治疗眼内炎症的治疗效果较差。眼内注射可造成眼内感染和出血并发症，全身用药易产生高血压和肝、肾毒副作用。因此，开发眼科局部植入型缓释剂成为眼科应用环孢素的突破口。研究表明，用聚乳酸制备环孢素眼植入剂具有良好的缓释效果。但聚乳酸载体降解产生乳酸单体可降低局
15、部的pH值，对周围组织有致炎作用9。交联HA凝胶载体降解产生寡糖类物质，不会影响组织液的pH值而产生致炎作用。酰肼交联HA凝胶呈有一定孔隙的网状结构，有良好的生物可降解性和生物相容性，HAse降解从凝胶膜表面开始深入到内部10。通过调节交联程度可以改变交联HA凝胶的药物释放速率，获得理想的缓释制剂6。 3.2环孢素眼植入凝胶膜药物释放的机制 包埋环孢素的交联透明质酸凝胶膜与释放介质接触后，凝胶中环孢素的饱和溶液被释放介质稀释，凝胶中的环孢素不断溶解，两者形成动态平衡。在凝胶未被降解破坏时，这种平衡不会改变，药物释放速度维持恒定，即药物释放速度不随凝胶中药物含量的减少而变化；当释放介质中加入HA
16、se，HAse降解凝胶中的HA，使凝胶网状结构不断破坏，大量环孢素暴露在介质中，药物释放速度加快，并随凝胶中HA的降解速度而变化。 3.3对环孢素眼植入凝胶膜的评价 文献报道，0.910 gmL-1浓度范围的环孢素即可有效地抑制体外培养的人结膜下成纤维细胞的增殖，致死量100 gmL-1 11。手术局部短时间接触2 环孢素注射液，即可提高青光眼手术成功率达90 以上，且术后低眼压和黄斑病变等后遗症较少。与其它抗细胞增殖药物相比，环孢素为一种相对安全有效的青光眼滤过手术抗瘢痕化药物12。本研究结果显示，在不含HAse的PBS中，环孢素眼植入凝胶膜的药物释放速度较慢，4周内累计释放不超过8 %，且
17、药物释放总量与时间呈直线关系，基本符合零级释放动力学理论，释放速度与交联HA凝胶的交联程度、环孢素溶解度以及释放介质的体积等因素有关；但释放介质中加入300 UmL-1 HAse，释放速度加快，释放药物6 h 达59.1 ，12 h达86.2 。由于HAse对交联HA凝胶降解，药物释放又增加了溶蚀机制，释放速度与HA的降解速度密切相关。人眼房水中HAse含量极微（210 UmL-1），HAse对凝胶膜药物释放的影响较小。环孢素眼植入凝胶膜的载药量约2.9 ，青光眼小梁手术使用等腰梯形凝胶膜小片（46 mg）含环孢素约116174 g。人眼前房容积300 L，房水排出率1.53 Lmin-1，估
18、计环孢素在小梁滤过组织局部的浓度可维持在抗成纤维细胞增殖的有效范围，基本满足抑制滤过组织瘢痕化的需要。房水组成成分复杂，除HAse外的其它成分是否影响环孢素眼植入凝胶膜的药物释放还有待进一步研究。 参考文献 1颜贞，涂家生，胡金山. 环孢素眼用制剂的研究现状J. 药学与临床研究，2008，16（1）：41-44. 2胡义珍，蔡世家，胡燕华. 环孢素与5-氟尿嘧啶用于青光眼滤过手术临床对比观察J. 美中国际眼科杂志，2001，1（4）：34-36. 3李美玉. 非穿透性小梁手术联合透明质酸钠生物胶植入术的临床疗效观察J. 中华眼科杂志，2001，37（6）：405-408. 4凌沛学，贺艳丽.
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