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1、PCR技术及临床应用、新冠病毒核 酸检测原理 授课人：刘翔宇 目 录 1核酸基本知识 2PCR的发展史 3PCR技术简介 4实时荧光PCR技术 5实时荧光PCR的临床应用 6新冠病毒核酸检测原理 一、核酸基本知识 核酸：生物贮存遗传信息物质的大分子，是生命的直接标志 核酸的分类：脱氧核糖核酸（DNA），核糖核酸（RNA）。DNA和 RNA的区别在于：DNA所含的戊糖为脱氧核糖，而RNA所含的戊糖 为核糖；在碱基成分中，DNA含胸腺嘧啶T，而RNA含脲嘧啶U。 核苷酸：是核酸的基本结构单位，核酸水解首先得到的是单核 苷酸，后者可进一步水解为核苷和磷酸，核苷可进一步水解为 戊糖（核糖和脱氧核糖），
2、和含氮碱基（嘌呤碱和嘧啶碱）。 核酸的基本结构 遗传信息传递的中心法则 DNA的复制：能在酶的作用下解链，根据碱基互补配 对的原则进行半保留复制。 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR ）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学 技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最 大特点是能将微量的DNA大幅增加。 二、PCR的发展史 1953年，沃森和克里克发现了DNA双螺旋的结构，开 启了分子生物学时代，极大地推动了核酸生物化学, 分子生物学及分子遗传学等各类生命科学的迅速发 展。 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis
3、 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。 1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其 扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望 的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。 1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合 酶，此酶的发现使PCR广泛的被应用。 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR 从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具 有特异性更强、PCR污染少、自动化程度高等特点 ，目前已得到广泛应用
4、。 第一代：手动/机械手式水浴基因扩增 用三个恒温水浴箱，分别将三个水浴温度恒定在三个温度：PCR 的高温变性温度（如94）低温复性温度（如58），适温延伸 温度（如72）。再用一个装有PCR标本试管的提篮，用手工在 不同温度的水浴箱中依次水浴。 这种方法的特点是：实验人员劳动强度大，容易因疲劳引起差错 ；而优点是:设备简单，投资少，与自动化基因扩增仪相比，它 无须升降温过程，实验时间短，试验更接近理想PCR反应条件。 第二代：自动化控制型PCR 使用广泛及具有代表性，采用琼脂糖电 泳的方式对PCR产物进行分析，但存在着操 作繁琐、只适用于定性研究、交叉污染风 险大等不足。且无法对起始模板准确
5、定量 ，无法对扩增反应实时检测。 第三代PCR：实时荧光定量PCR 为了避免上述传统PCR的缺陷，并对基因的表 达水平进行定量分析，1992年诞生了所谓“第 三代PCR的荧光定量实时PCR。 所谓real-time Q-PCR技术，是指在PCR反应 体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实时 监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知 模板进行定量分析的方法。 第四代PCR：数字PCR 由于定量PCR的分析最终结果依赖于Ct值，在这个意义上所谓的“定量 ”也只是相对的。而且在低拷贝靶分子、模板浓度差异细微的条件下 ，其检测的灵敏度、精确度都受到了限制。在这种背景下，“数字 PCR应运而生。 数字
6、PCR是一种核酸分子绝对定量技术。相较于实时荧光定量PCR，数 字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定 量。 因此特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域：拷贝数变异、突 变检测、基因相对表达研究（如等位基因不平衡表达）、二代测序结 果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。 三、PCR技术简介 高温可以使双链DNA解链成为单链，这一过程 称为变性。 变性后的DNA通过降温可以重新接合为双链， 这一过程称为复性。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过 程，它的特异性取决于与靶序列两端互补的 寡核苷酸引物。 利用温度的升降来控制DNA的变性和复 性。
7、设计引物作为启动序列，加入DNA聚合 酶、dNTP（三磷酸脱氧核甘酸）等原料完 成特定基因的体外复制。 周而复始的升降温度进行扩增，每一循环 可以使靶序列增加一倍。 PCR扩增步骤 DNA变性（90-96）：双链DNA模板在热作用下，氢 键断裂，形成单链DNA。 退火（25-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结 合，形成局部双链。 延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，以dNTP（三磷 酸脱氧核甘酸）为原料，从引物的5端3端延伸，合 成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延 伸，DNA的含量既增加一倍。 PCR扩增示意图 30次循环后靶序列扩增的数量 No. ofNo. Amp
8、licon CyclesCopies of Target 12 24 38 416 532 664 201,048,576 301,073,741,824 常用的技术 定性 l 电泳检测、放射自显影 l 特异性差、易污染、只能定性 l 特异性较好，极易污染、定量不准确 终点法荧光 l 特异性很好，不易污染，定量线性范围小，重复性不好 实时荧光 l 特异性很好，不易污染，线性宽重复性较好 四、实时荧光PCR技术 实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信 号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行 定量分析的方法。 定量PCR仪是在普通PCR仪的基础上加装了
9、荧光激发装置和荧光检 测装置，PCR扩增和检测同时进行，最终结果不需进行电泳检测， 所以有效地避免了样品间的交叉污染。 荧光PCR的原理 实时荧光PCR常用的三个概念 扩增曲线：反映PCR循环次数和荧光强度的曲线，定量PCR仪每次PCR扩 增都会自动记录荧光强度的变化 荧光阈值：在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光 信号指数扩增阶段任意位置上，仪器可自动计算，手动设置的原则要 大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进 入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99。 Ct值： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经 过的扩增循环次数。 实时
10、荧光PCR扩增曲线示意图 手工调整荧光阈值示意图 Ct值的意义 Ct值与重复性 同一样本在相同条件下同时进行96次 扩增 Ct值与浓度 不同浓度的模板达到荧光域值时 的Ct值不同 PCR扩增的理论模式 Yn=X*(1+E)n ，0E1，E为扩增效率,X为原 始模板数,Y为PCR产物的分子数量,n为周期数。 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少， 即Ct值越小。 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷 贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值 ，就可以计算出样品中所含的模板量。 标准曲线的建立 梯度稀释后，标准品的扩增曲线间距相等，标准曲线上的间距也相等， 说明标准曲线建立的很成功
11、，假如间距参差不齐，说明梯度稀释时操作 误差太大，建议重新做标准品的梯度稀释，重新做标准曲线，直到扩增 曲线之间的间距相等为止。因为这一步直接影响着样品中目的基因 原始模板量的准确性。 实时荧光定量PCR技术的特点 灵敏度高 特异性强 快速简便 应用范围广 五、实时荧光PCR的临床应用 感染性疾病的诊断 母婴传播的控制与观察 遗传疾病的诊断 肿瘤的诊断 法医学鉴定 早期诊断 病情评估和预后判断 抗病毒药物疗效的观察、指导 新药验证 感染性疾病的诊断 1. 病原体含量与病情之间的关系 2. 病原体含量与用药之间的关系 3. 药物及疗法的研究与开发 4. 新的病原体分子诊断标准 5. 新的愈后指标 6. 传染病发病的监控、预测与预防 六、新冠病毒核酸检测原理 对新型冠状病毒（2019-nCoV） ORF 1ab 及编码核衣壳蛋白 N 或E基因的特异性保守序列为靶区域， 进行了双靶标基因的设计， 配以PCR 反应液， 在荧光定量 PCR 仪上， 应用实时荧光定量 RT- PCR 检测技术， 通过荧光信号的变化实现样本新型冠状病毒RNA 的 检测。