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1、荧光定量PCR引物设计要求荧光定量PCR引物的具体设计要求：1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好位于编码区5端的300-400bp区域内，可以用DNAman,Alignment 软件看看结果。2. 产物不能形成二级结构(自由能小于58.61KJ/mol)。3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。4.G+C含量在40%60%之间，45-55%最佳。5.碱基要随机分布，尽量均匀。6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。8.引物5端可以修饰。9.3端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构(2-
2、3个)。10. 引物3端要避开密码子的第3位。11.引物整体设计自由能分布5端大于3端，且3端自由能最好小于9KJ/mol。可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp.13.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70%或者有8个互补碱基同源。15.查看有无假基因的存在。假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似。16.TM值在58-62度之间。17.引物设计的软件Primer 5.0 有专门针对荧光的。ATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGT
3、TTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAAGTATGACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTTCGGTGAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGGCTGGGGCTGACTTTGTGGTCGAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGGTGCAAAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGTG
4、TCAACGAGAAGGAATACACACCCGAGCTTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGCCAAGGTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTGTGCACGCTATGGCTGCCACTCAAAAGACTGTTGATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAG5 GAGAAGGAATACACACCCGAGC 35 GACCACAAAGTCAGCCCCAG 3ATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACA
5、TATATGTTCAAGTATGACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTTCGGTGAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGGCTGGGGCTGACTTTGTGGTCGAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGGTGCAAAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGTGTCAACGAGAAGGAATACACACCC
6、GAGCTTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGCCAAGGTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTGTGCACGCTATGGCTGCCACTCAAAAGACTGTTGATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAG5 GAGAAGGAATACACACCCGAGC 35 CAACAGTCTTTTGAGTGGCAG 35 GAGAAGGAATACACACCCGAGC 35 GCACAGTTGTCATAAGACCCTCAAC 35 GAGAAGGAATACACACCCG
7、AGC 35 GACCCTCAACAATGCCAAACC 35 CAACGAGAAGGAATACACACC 35 ACCCTCAACAATGCCAAAC 3TKGAPDH内参qRT-PCR引物的设计如下：1.119bpATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAAGTATGACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTTCGGTGAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGG
8、TGAGGCTGGGGCTGACTTTGTGGTCGAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGGTGCAAAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGTGTCAACGAGAAGGAATACACACCCGAGCTTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGCCAAGGTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTGTGCACGCTATGGCTGCCACTCAAAAGACTGT
9、TGATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAGTKGAPDH-qF 5 GTCAACGAGAAGGAATACACACC 3TKGAPDH-qR 5 AGACCCTCAACAATGCCAAAC 32. 156bp ATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAAGTATGACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTTCGGTGAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATA
10、TCCCATGGGGTGAGGCTGGGGCTGACTTTGTGGTCGAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGGTGCAAAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGTGTCAACGAGAAGGAATACACACCCGAGCTTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGCCAAGGTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTGTGCACGCTATGGCTGCCACTCAAAAGACTGTTGATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAGTKGAPDH-QF 5 GAGAAGGAATACACACCCGAGC 3TKGAPDH-QR 5 AACAGTCTTTTGAGTGGCAGCC 3