生物化学 ppt第8章 酶通论.ppt

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1、第8章 酶通论,Enzyme,酶的发现及研究历史,人们对酶的认识起源于生产与生活实践。 夏禹时代，人们掌握了酿酒技术。 公元前12世纪周朝，人们酿酒，制作饴糖和酱。 春秋战国时期已知用麴(曲)治疗消化不良的疾病。 酶者，酒母也,酵素的发现,enzyme (in yeast),enzyme是希腊文 en = in ， zyme = yeast,什么是酶？,酶是生物催化剂 生物体一切生化反应都需酶催化才能进行！ 性能远远超过人造催化剂 定义：由活细胞产生的、 有高度专一性和 高效催化作用的生物大分子。,一、酶催化作用的特点,1. 提高反应速度，不改变平衡点; 2. 只起催化作用，本身不消耗； 3.

2、 降低反应的活化能。,（一）与一般催化剂相同的特点,活化能(activation energy) 指在一定温度下，1mol底物全部进入活化态所需要的自由能 单位：KJ/mol,酶催化反应的实质：,降低反应的活化能,1. 易失活（温和性）,（二） 生物催化剂的特点,常温、常压、中性,除个别RNA为催化自身反应的酶外，其余所有的酶都是蛋白质。,2. 高效性,且无副反应,反应速度是无酶催化/普通人造催化剂催化反应速度的1061016倍。,3.专一性,Specificity: 酶对催化的反应和反应物有 严格的选择性。,底物（Substrate): 酶作用的物质。,（1）酶浓度的可调性 （2）通过激素调

3、节酶活性 （3）反馈抑制调节酶活性 （4）抑制剂和激活剂 （5）别构调控、共价修饰、同工酶等,4. 可调节性,二、酶的化学本质及分类,经酸碱水解终产物是AA 能被蛋白酶水解而失活 酶可变性失活 酶是两性电解质 具有不能通过半透膜等胶体性质 具有蛋白质的化学呈色反应,化学本质是蛋白质,（一）酶的化学本质,1982年T.Cech发现了第1个有催化活性 的天然RNAribozyme（核酶）， 以后又陆续发现了真正的RNA催化剂。,单纯酶 ：只有蛋白质 结合酶（缀合酶）：脱辅酶 + 辅助因子,辅助因子,辅基,辅酶,与酶结合紧,与酶结合松,全酶,（二）酶的化学组成,羧肽酶,结合酶中： 单独酶蛋白或辅助因

4、子没有催化活性 一种酶蛋白一般只与一种辅助因子结合 同种辅助因子可与不同的酶蛋白结合,酶蛋白：决定反应的专一性 辅助因子：传递电子、原子或某些 化学基团的作用,monomeric enzyme：一般由一条肽链组成 oligomeric enzyme：为寡聚蛋白，2个亚基 multienzyme complex：几种酶靠非共价键 彼此嵌合而成。 由数个独立的酶组合起来形成络合体，催化一系列反应。（如糖代谢、脂代谢）,（三）单体酶、寡聚酶、多酶复合体,根据酶蛋白分子的特点：,三、酶的命名和分类,（一）习惯命名法,根据其催化底物来命名； 根据所催化反应的性质来命名； 结合上述两个原则来命名， 有时在

5、这些命名基础上加上酶的来源或其它特点。,优点 命名简单 应用历史较长，使用方便 缺点一名数酶、一酶数名 为了适应酶学发展的新情况，国际酶学会议于1961年提出一个新的系统命名法及分类原则，已被国际生化协会采用。,（二）国际系统命名法：,系统名称包括底物名称、反应性质，最后加一个酶字。,底物1 ：底物2 + 反应性质+酶,乳酸 + NAD+,丙酮酸 + NADH + H+,乳酸：NAD+氧化还原酶,当底物为水时，可省略,系统名：包括所有底物的名称和反应类型。,惯用名：只取较重要的底物名称和反应类型。,对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型。,（三）国际系统分类编号,1961年国际酶学委

6、员会（Enzyme Committee, EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类：,氧化-还原酶催化氧化-还原反应，催化氢的转移或电子传递。 主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。 如，乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。,1、氧化还原酶 Oxidoreductase,（四）六大类酶的特征,（1）脱氢酶类：催化直接从底物上脱氢的反应,（2）氧化酶类,催化底物脱氢，氧化生成H2O2：,催化底物脱氢，氧化生成H2O：,（3）过氧化物酶,（4）加氧酶（双加氧酶和单加氧酶）,转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的

7、分子上。 根据X分类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烃基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。 例如， 谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。,2、转移酶 Transferase,水解酶催化底物的加水分解反应。 主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。 例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：,3、水解酶 hydrolase,裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。 主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。 例如， 延胡索酸水合酶催化的反应。,4、裂合酶 Lyase,异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。 例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应,5

8、、异构酶 Isomerase,P,P,合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。 例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。 丙酮酸 + CO2 草酰乙酸,6、合成酶 Ligase or Synthetase,酶的系统编号：4位数字 第一位：代表六大类反应类型 第二位：亚类（作用的基团或键的特点） 第三位：亚亚类（精确表示底物/产物的性质） 第四位：在亚亚类中的序号,指酶对底物的选择性，也称特异性。,结构专一性,立体异构专一性,绝对专一性,相对专一性,族专一性,键专一性,旋光异构专一性,几何异构专一性,四、酶的专一性,（一）酶的专

9、一性,（1）锁钥学说刚性构象 （2）诱导契合学说 （3）结构性质互补学说 静电效应、极性相同 （4）三点附着学说 立体异构专一性的酶,（二）与酶专一性有关的学说,锁钥学说,认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样,诱导契合学说,酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状.,（Koshland，1958）：当底物和酶接触时，可诱导酶分子的构象变化，使酶活性中心的各种基团处于和底物互补契合的正确空间位置，有利于催化。,羧肽酶的诱导契合模式,“三点结合”的催化理论,酶与底物的结合处至少有三个点，而且只有一种

10、情况是完全结合的形式。只有这种情况下，不对称催化作用才能实现。,（一） 酶活力与酶促反应速度 酶活力就是酶催化反应的能力 能催化多快的反应 通常以测出的酶促反应速度表示,五、酶的活力测定和分离纯化,单位时间内底物的减少或产物的增加,1. 酶促反应速度的测定方法,产物浓度变化曲线,用哪一个速度来表示 酶促反应的速度特征呢？,反应初速度 Vo,反应初速度表示酶活力,2.活力单位 (U),酶单位（U）： 在一定条件下、一定时间内、将一定量的 底物转化为产物所需的酶量。 如： 每小时催化1克底物 每小时催化1ml某浓度溶液 每分钟催化1ug底物,一定时间,一定量底物,一定条件下,在标准条件下（25 ，

11、最适pH和最适底物浓度）一分钟内催化1微摩尔底物转化为产物所需的酶量。 1 IU= 1 mol / min 酶活力单位标准化,（1）国际单位（IU）,在标准条件下（25 ，最适pH和最适底物浓度）每秒钟催化1摩尔底物转化为产物所需的酶量。 1 Kat =1 mol/s = 60106 IU 酶活力单位标准化,（2）Kat,每mg酶蛋白所含的酶活力单位数。 u/mg酶蛋白 酶产品质量评价中常使用， 一定程度上代表酶的纯度。,（3）比活力 (specific activity),一定条件下： 每秒钟、每个酶分子转换的底物分子数 或每微摩尔酶分子转换底物的微摩尔数 一秒内1摩尔的酶可催化几摩尔的底物

12、,（4）转换数（turnover number）,酶活力测定实例,确定反应条件 20、pH=7，底物浓度 6g/l（过量）， 加入2mg固体脂肪酶 确定活力单位 每小时催化1克底物 1u= 1g/h 测反应初速度 作产物甘油随时间增加的曲线， 量出反应初速度值 ， 换算为脂肪的消耗速度。如 8g/h 换算活力 8g/h / 1g/h=8u 计算比活 8u/2mg酶蛋白=4u/mg酶蛋白,测定完成一定反应所需的时间 测定单位时间内酶催化的化学反应量 （1）分光光度法： 利用底物/产物光吸收性质不同 选择适当波长来测定。 （2）荧光法： 利用底物/产物荧光性质的差别。,紫外/可见光,3. 酶活力的

13、测定方法,（3）同位素测定方法： 放射性同位素标记底物， 经酶作用得到相应产物， 经适当分离，测定产物脉冲数即可。 （4）电化学法： 包括pH测定法，离子选择电极法等。 前者跟踪反应过程中H+的变化， 后者用氧电极测定一些耗氧的酶反应。,（二）酶的分离和纯化,衡量分离提纯效果的两个指标： 总活力的回收 是表示提纯过程中酶的损失情况 比活力提高的倍数 是表示提纯方法的有效程度,分离纯化方法同蛋白质纯化类似： 1.选材：酶含量丰富的新鲜生物材料 2.破碎：因材料而异,3.抽提：低温下以水或低盐缓冲液抽提 4.分离及纯化：粗分级，细分级分离,5. 结晶 6.保存：低温下酶粉可长期保存,注意低浓度酶溶

14、液易变性,酶的制备过程中，每步都应进行鉴定 常用的鉴定指标为： 回收率每次总活力100 /第一次总活力 纯化倍数=每次比活力/第一次比活力,产率,酶的纯度鉴定： 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 等电聚焦电泳法,六、核酶（ribozyme),（一）核酶：具有催化活性的RNA (1) 1982年，Cech首先发现四膜虫 L19RNA既有RNA酶活性，又有 RNA聚合酶活性。,随后的研究表明： L19RNA具备酶促催化的几个特征： 高度的底物专一性 遵循Michaelis-Menten动力学 对竞争性抑制剂的敏感性,(2) 1992年，Piccirilli等发现L19RNA具有氨酰酯酶的活性，催化氨酰酯水解。

15、 (3) L19RNA还有限制性内切酶作用： -CpUpCpUpN- + G -CpUpCpU +GpN,(4) 1997年，Zhang和Cech用人造的RNA分子催化合成了肽链，表明RNA具有肽基转移酶活性。 (5) 原核生物RNaseP和 兔肌1，4- -葡聚糖分枝酶,均包括RNA+蛋白组分， 起催化作用的都是RNA。,（二）核酶的种类（自我催化） 自我剪切： 是转录后加工方式之一 （self- cleavage） 自我剪接 （self-splicing）,需要鸟苷和Mg2+参与,不需要鸟苷的参与,剪切与连接,催化分子内反应,核酶的典型结构特点：,三个螺旋,13个保守碱基,剪切点：GUN,

16、RNA既能携带遗传信息 又有生物催化功能。 RNA可能早于蛋白质和DNA， 是生命起源中首先出现的生物大分子 切割癌基因、致病病毒基因,（三）核酶的研究意义与应用前景,是具有催化作用的抗体 本质是免疫球蛋白 在易变区被赋予酶的属性， 又被称为催化性抗体。,基态底物 过渡态底物,七、抗体酶（abzyme),第一代抗体酶 （过渡态底物的抗体） 1986年，Schultz与Lerner同时得到了具有催化活性的抗体；,第二代抗体酶 （引入法） 将催化基团及辅助因子引入到抗原抗体结合部位。,第三代抗体酶 （拷贝法） 酶 抗体 抗抗体,酶工程：酶制剂在工业上的大规模生产及应用。 普通酶工程、化学酶工程、生

17、物酶工程 普通酶工程 单纯生物提取,化学酶工程 1、微生物发酵得到粗酶 2、对天然酶进行化学修饰、固定化处理， 利用化学合成等手段来改善酶性能。,八、酶工程简介,A 修饰酶的功能基团： 亲核的Ser、Cys、Thr、Lys、His， 亲电的Tyr、Trp 可氧化的Tyr、Trp、Met 经过修饰的酶稳定性好。,（1）化学修饰酶,B 交联反应： 用双功能试剂使酶分子间或分子内发生交联反应，经过交联后的酶对热变性和蛋白质水解酶的稳定性增加。,C 大分子修饰作用： 可溶性高分子化合物如肝素、葡聚糖、聚乙二醇可修饰酶蛋白的侧链，提高酶的稳定性，改变酶的一些重要性质。,酶的固定化是把水溶性酶经物理（吸附

18、法与包埋法）或化学方法（共价偶联法与交联法）处理后，使酶与惰性载体结合或将酶包埋起来成为一种不溶于水的状态。,（2） 固定化酶,固定化优点： 稳定性提高，酶易于分离重复使用。,吸附法：使酶被吸附于惰性固体的表面，或吸附于离子交换剂上。 包埋法：使酶包埋在凝胶的格子中或聚合物半透膜小胶囊中。,偶联法：使酶通过共价键连接于适当的不溶于水的载体上 交联法：使酶分子依靠双功能基团试剂交联聚合成“网状”结构,酶电极,酶电极,生化信号,电极敏感膜,底物,换能元件,电信号,放大处理,记录仪,电极： O2 NH4 + H+ NH3 CO2,固定化葡萄糖异构酶 葡萄糖 果糖 42%高果糖玉米糖浆：215万吨/年 55%高果糖玉米糖浆：145万吨/年,难度大，产品活性低，发展缓慢。,（3）化学合成酶：,生物酶工程,利用DNA重组技术改造和生产酶的工程方法。,优点？ 不受天然来源限制，迅速，且易于诱变改造,酶产品,外源基因,生物体中存在的酶基因 克隆酶,修饰基因 定点突变酶,人工设计合成的基因 新酶,