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1、碱裂解法提取质粒一、基本概念 1质粒：质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。许多细菌除了染色体外，还有大量很小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)。质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进细菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。 目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是
2、闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%3%。根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40106以上，较小一类的相对分子质量是10106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有12个质粒;另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和
3、它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。 在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。但是如果将DNA片段插入到HindIII、BamHI或SalI切点，就会使抗四环素基因失活。这时，含有DNA插入片段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。没有DNA
4、插入片段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素，而没有pBR322质粒的细菌将对氨苄青霉素和四环素都敏感。pSC101与pBR322相似，只是没有抗氨苄青霉素基因和PstI切点。质粒运载体的最大插入片段约为10kb(kb表示为千碱基对)。pGEX-4T1是pGEX载体系列的一种，载体图如图2所示，这类载体是溶蛋白表达、纯化和检测为一体的整合系统。具有以下优点：有一个可以用化学物质（IPTG）诱导的高效表达的tac启动子；一个lacIq基因以便通用于所有E.coli宿主中；一个AmpiR基因以便于阳性克隆的筛选。 pGEX-4T1载体示意图2感受态细胞：重组DNA分子体外构建完成后，
5、必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。 所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的
6、关键。 制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70保存（有效期6个月）。3.转化:是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。转化的方法：化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞；电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导
7、入受体细胞。二、碱裂解法质粒提取的原理碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。下面是该法的提取原理: 碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；(N相当于g/L，是当量浓度)溶液III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。 溶液I的作用任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大
8、肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入EDTA是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。 溶液II的作用这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于
9、细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DN
10、A也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦。 溶液III的作用溶液III加入后就会有大量的沉淀，与SDS的加入有关系。十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）SDS遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉
11、淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。 2 M的醋酸是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。很多人误认为是溶液III加入后基因组DNA无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本来是为了溶解细胞而用的
12、，DNA分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。溶液III加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点。 酚/氯仿纯化 不要以为PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，不然时间一长就会因为混入的DNase而发生降解。这里用25/24/1的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的，这里做个全面的介绍。酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氰酸胍），离心后
13、酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。 回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。
14、这时候如果放到20，时间一长反而会导致大量盐的沉淀，这点不同于普通的DNA酒精沉淀回收，所以不要过分小心了。高浓度的盐会水合大量的水分子，因此DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。如果感觉发生了盐的沉淀，就用70的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，并用tip将沉淀打碎，就能得到好的样品。得到的质粒样品一般用含RNase（50 ug/ml）的TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的。质粒检测 琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带，但千万不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，不信的话你用EcoRI来线性化
15、质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。 非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会有710条带，这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。三、实验步骤1大肠杆菌感受态细胞的制备（可临用前准备，也可制备多管加甘油冻存-80）（1）从新鲜的DH5菌株平板上挑取一个单菌落，（接种到4ml LB液体培养基中）
16、37，180rpm培养过夜。（2）次日按照1：100的比例转接培养物于20mlLB液体培养基当中，37，180rpm培养至OD值达到0.4-0.6。（3）取培养物1ml到1.5ml 离心管中，冰浴10min，5000rpm离心5min收集菌体。（4）弃上清，加入预冷的0.1M CaCl2 1ml 后旋起菌体（在涡旋器上振荡），冰浴30min。（5）5，000rpm离心10min后弃上清，加入预冷的0.1M CaCl2 100ul。（6）温和混匀后4放置24-48h备用。2质粒的转化（1）取制备好的感受态菌体，加入质粒5ul（可变）。（2）冰浴30min后，42水浴热激90s（温度准确，速度要快
17、把握好时间）。（3）取出后再冰浴5min；加入800ul LB液体培养基。（4）37，150rpm复苏1h。（5）取10ul培养物涂布于含有抗生素的LB（由质粒的抗性决定），37倒置培养。（对照组不加抗生素）3质粒提取（或用试剂盒提取）（1）从4拿出长满菌体的LB平板，打开培养皿，用在酒精灯上烧过的镊子夹取100ul的吸头挑取单菌落，之后把带有菌落的吸头放入带有抗生素的LB液体培养基（4ml或10ml，认真标记）37振荡培养过夜。（若是第二天进行二次活化，则按照1：20的比例接种培养基，37振荡培养3小时，记得加抗生素）。（2）取1ml菌液加入1.5ml的离心管中，认真标记后把剩余的菌液冻存（
18、0.5ml的菌液，0.5ml纯的甘油，认真标记）12，000rpm离心5min收集菌体。（3）5000rpm离心5min收集菌体，弃上请后再离心5s,吸取残余的上清。（4）向每个离心管中各加入100ul预冷的溶液,在混悬器上振荡使菌体充分悬浮，分散。（在冰上）（5）再向每个离心管中各加入200ul新配制的溶液，缓慢倒转几次混匀。（在冰上）（6）向每个离心管中各加入150ul溶液，缓慢倒转几次混匀。（在冰上）（7）12，000rpm离心10min，转移上清至一新离心管中。（8）向每个离心管中各加入酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），颠倒混匀后12，000rpm离心10min。（9）吸取上清（注意
19、不要吸到中间层）到1.5ml离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，于-20放置20-30min（或室温放置10min）12，000rpm离心10min，弃上清，（小心不要把质粒倒掉）（10）加1ml 70乙醇洗涤沉淀（来回颠倒旋转几次），12，000rpm离心3min，弃上清，室温干燥20min，将沉淀溶于20ul的TE或水中，-20备用。注：一般在第二步离心收集完菌体后再加入1mlSTE，充分洗涤菌体，12，000rpm，离心12min。4质粒检测琼脂糖凝胶电泳核酸DNA在PH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。琼脂糖具有多孔的网状结构，不同大小的核酸分子利用凝胶的分子筛效应得
20、以分开。实践中观察琼脂糖凝胶中DNA是利用荧光染料溴化已锭（EB）将DNA染色。溴化已锭与DNA结合，在254nm波长的紫外灯下呈现橙黄色的荧光条带。（1）以配制浓度为1%胶为例：取一个50ml锥形瓶（制胶专用），加入0.5g琼脂糖后加1TAE至50ml放入微波炉内加热（火力中高，时间3min），待液体沸腾后拿出锥形瓶（注意不要烫住手），用吸取50ul的EB（1：1000）加入锥形瓶内。等到锥形瓶不烫手后向制胶板内倒胶，高度不要漫过制胶板沿，冷却，待胶凝固后拔出梳子。（2）配制电泳液：取一个500ml的广口瓶，加入10ml 50TAE，加双蒸水至500ml。（3）待胶板放进电泳槽后向电泳槽内加
21、入配好的电泳液，高度漫过胶板1mm。 （4）点样：拿出裁成长条的称量纸光面向上（或一次性手套），用10ul移液器吸取3ul的质粒，打在称量纸上，再用10ul移液器吸取2ul的上样缓冲液和质粒混匀，吸取混合液5ul打入点样孔。（5）电泳：接通电源，电压设定在80v（可变），开始电泳。（6）凝胶系统成相：等到指示剂快跑到胶板前沿时关闭电源，拿出胶板，放在暗箱内，打开与暗箱相连的电脑，进入摄像软件，进行摄像，然后保存照片。注：DNA分子的大小 在凝胶中，DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DN
22、A分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。琼脂脂糖的浓度 如下表所示，不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。不同浓度琼脂糖凝胶分离DNA片段的范围琼脂糖浓度 /%0.30.60.70.91.21.52.0线状DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1四、溶液配方（详细参考分子克隆实验指南）LB液体培养基：每配制1000ml加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g。LB固体培养基：每配制1000ml加入胰蛋白胨10
23、 g、酵母提取物5g、NaCl 10g、琼脂糖1.5g。溶液：50 mM葡萄糖，25 mM Tris-HCl (pH8.0)，10 mM EDTA (pH8.0)。溶液：0.2 M NaOH(临用前用10 M贮存液稀释)，10%SDS(现用现配)。溶液：60ml 5 M乙酸钾，11.5ml冰乙酸，28.5ml水。TAE(50)：242g Tris碱，57.1 ml冰乙酸，100 ml 0.5 M EDTA (pH8.0)，用时稀释50倍。加样缓冲液(6)：0.25%溴酚蓝，40%(w/v)蔗糖水溶液。溴化乙锭（或其无毒替代品）：10mg/ml。 RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/L
24、 TrisCl(pH7.5), 15mmol/L NaCl中,配成10mg/ml的溶液,于100加热15分钟,使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5ml eppendorf管分装成小份保存于-20。STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L TrisCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。五、常见问题1. 加入solution.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，有的漂浮在液面，有的贴在离心管壁上，一摇晃即破碎脱落下来？ 细菌的用量太少，导致产生的沉淀主要是盐分的沉淀，因为缺少变性的细菌蛋白和细菌基因组DNA 的缠绕，沉淀就显得不结实。解决方法：将细菌的用
25、量增加。2.加入soln.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，呈大块的水泡状，上清较少？ （1）使用了过多的细菌，导致菌体未被有效裂解。解决方法：将细菌用量减半。 （2）细菌悬浮不充分,存留小菌块, 导致菌体未被有效裂解。解决方法：注意将细菌悬浮充分。 （3）加Solution III后中和不充分。解决方法：如果细菌用量较多，请注意多翻转几次直至中和后的沉淀呈松散的豆腐花状(也可以稍用力混合直至沉淀呈松散的豆腐花状)。 （4）Solution II出现沉淀。解决方法：如果实验室内温度低于15，使用试剂盒前请注意观察Solution II中是否出现沉淀。如果出现沉淀，请于37水浴溶解沉淀
26、后再使用。 （5）Solution II 长时间暴露于空气中被CO2中和，导致菌体未能被有效裂解。解决方法：可用经典碱裂解法抽提质粒DNA方法中的II液替代 Solution II使用。3.出现严重的RNA污染？ （1）未在Solution I中事先加入RNase A1。解决方法：补加RNase A1。 （2）加入RNase A1的Solution I长期保存于室温，导致RNase A1活性下降。 （3）细菌过量,RNase A1不能有效降解RNA。解决方法：将细菌用量减半或增加RNase A1在Solution I中的浓度。4.抽提的质粒DNA电泳时怎么出现切口.断裂或降解现象？ （1）使用
27、的是收集后冷冻保藏的细菌。解决方法：使用新鲜培养的细菌。 （2）宿主菌富含核酸内切酶。解决方法：增加一步Rinse A洗涤步骤以彻底去除残留的核酸内切酶。或者将质粒DNA进行乙醇沉淀。 （3）质粒DNA在Solution II中暴露过久，易造成质粒DNA的切口断裂。裂解步骤控制在5分钟内完成。 （4）培养的细菌被杂菌污染。解决方法：重新挑取单菌落培养细菌。 5.抽提的质粒DNA电泳时怎么出现基因组DNA的污染？ （1）菌体裂解和中和过程中,剧烈混合造成基因组DNA断裂所致。解决方法：温和地进行菌体的裂解和中和。 （2）加Solution II时操作时间过长，造成基因组DNA断裂所致。解决方法：
28、将裂解步骤控制在5分钟内完成。 （3）细菌的质量差（反复冻融的细菌，陈旧的细菌，培养条件不合适的细菌等）中有许多断裂或降解而游离的基因组DNA，使用生长良好的新鲜细菌。 6.加样时DNA飘出加样孔外？ 忽略或省略了高速离心以甩干残留的Rinse B的操作步骤。解决方法：按说明书的操作步骤操作以确保残留的Rinse B被甩干。 7.为什么提出的质粒的多是二聚体和多聚体形式？ 是在质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出。8.质粒为何会丢失？ 细菌培养不要超过16小时，否则细菌会崩溃，引起细菌大量死亡，导致质粒丢失。有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。11兰花书屋