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1、血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳,1,血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳,血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳,2,实验目的,掌握电泳的基本原理，了解电泳仪、电泳槽的基本结构与功能。 熟悉电泳的基本过程与定量方法。 熟悉血清电泳在临床诊断的作用。,血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳,3,实验原理,PHPI时，蛋白质带正电荷，移向负极 PHPI时，蛋白质不带电荷 PHPI时，蛋白质带负电荷，移向正极 迁移率：是指单位电场强度是离子运动的速度，也称电泳度。 醋酸纤维素薄膜电泳：以醋酸纤维素薄膜为支持物的电泳。醋酸纤维素是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成。将醋酸纤维素溶于丙酮等有机溶液中，可涂布形成均一细密的微孔
2、薄膜，厚度约0.10.15mm。,血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳,4,血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳,5,血清中各种蛋白质的等电点不同，在同一高于其等电点的PH值缓冲液中，他们都带负电荷，但电荷数量不同。同时，各种蛋白质的分子大小不一，所以在同一电场的电泳迁移率不同。在醋酸纤维素膜上可分为五条区带。电泳迁移率最大的是白蛋白，其后依次为1、 2、 和 球蛋白。染色后经透明处理可直接在光密度计上扫描定量。,血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳,6,实验器材与试剂,器材 电泳槽、电泳仪、脱色摇床、染缸、滤纸、醋酸纤维素薄膜、点样器 DYY-5型稳压稳流电泳仪 DYY-3型电泳箱,血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳,7
3、,试剂：,电极缓冲液：巴比妥缓冲液（PH8.58.7、I=0.06）:称取巴比妥2.21g、巴比妥钠12.36g于500ml蒸馏水中，加热溶解，待冷却至室温后，用蒸馏水补足至1L。 染色液：氨基黑10B染色液：称取氨基黑10B0.1g，溶于无水乙醇20ml中，加冰醋酸5ml、甘油0.5ml，使溶解，然后将磺柳酸2.5g溶于少量蒸馏水中，加入前液，再以蒸馏水补足至100ml。,血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳,8,续：试剂,漂洗液：甲醇45ml、冰醋酸5ml和蒸馏水50ml，混匀。适用于氨基黑10B染色的漂洗。 透明液：称取柠檬酸21g和N-甲基-2-吡咯烷酮150g，以蒸馏水溶解，并稀释至50ml
4、。亦可选用十氢萘或液体石蜡透明（注明各试剂的作用),血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳,9,实验操作,准备：将巴比妥缓冲液加入电泳槽的电极室内，是正负极室的吖液面等高，电泳支架宽度正好适合醋纤薄膜的长度，用四层纱布或滤纸做盐桥，一端浸入缓冲液中，一端搭在支架上。 浸膜：先于膜条无光泽面距一端1.5cm处用铅笔轻划一直线（点样线），再将薄膜无光泽面向下浸泡于巴比妥缓冲液中，浸透为止（约1020min）。当膜条无可见的白斑或点状的不透明区时，取出，将薄膜无光泽面向上，平放于干净滤纸，薄膜上再放一张干净滤纸轻轻吸去多余的缓冲液。,血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳,10,点样:用滴管吸取待测血清一滴于玻璃片上，
5、用点样器或宽1.5cm的X光软片末端处蘸取少许样品，垂直轻印（迅速均匀）到薄膜点样线上，使血清完全渗透到薄膜内，形成一定宽度、粗徐均匀的直线。（注：点样量不宜过多！） 这是关键步骤，印章法加样时，动作应轻、稳，用力不能太重，以免将薄膜弄破或印出凹陷而影响电泳区带分离效果。点样前可先在滤纸上反复练习，掌握点样技术后再正式点样。,血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳,11,平衡：将膜条无光泽面向下置于电泳槽支架上，点样端靠近负极，薄膜两端要紧贴纱布或滤纸，中间平直悬空，加盖密封，平衡5分钟。 电泳：将电泳槽正负极与电源正负极接好。开启电源，调节电流密度为0.5mA/cm,如有10条宽2cm的膜条，其总宽度
6、为20cm,应使用电流强度为20cm*0.5mA/cm=10mA。电压15V/cm。通电50分钟左右，使电泳区带展开33.5cm。关闭电源。 染色：取下薄膜直接浸于氨基黑10B染色液中，染色510min（以蛋白带染透为止），然后在漂洗液中漂去剩余染料，直至背景无色为止。漂洗液可回收。,血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳,12,7.定量（光密度计扫描法）,透明：吸取薄膜上的漂洗液（以防止透明液被稀释影响透明结果），将薄膜浸入透明液中23分钟（延长一些时间亦无碍）。取出，以滚动方式平贴于洁净无划痕的载玻片上（勿产生气泡）。将此玻璃片树立片刻，除去一定量透明液后，置已恒温90100C烘箱内烘烤1015mi
7、n，取出冷至室温。 用此法透明的各蛋白质区带鲜明，薄膜平整，可供直接扫描和永久保存（若用十氢萘或液体石蜡透明，应将漂洗过的薄膜烘干后进行透明，此法透明的薄膜不能久藏，且易发生皱折）。 扫描定量：将已透明的薄膜放入全自动光密度计或其他光密度计暗箱内，进行扫描分析。,血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳,13,计算公式： 各组分蛋白质%=Ax/At*100 （ Ax:各组分蛋白质的吸光度。 At:各组分蛋白质吸光度的总合。） 各组分蛋白质的绝对浓度（g/L）血清总蛋白（g/L）*各组分蛋白质的百分浓度（）,血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳,14,注意事项:,每次电泳时应交换电极可使两侧电泳槽内缓冲溶液的正负离
8、子相互交换，使缓冲液的pH值维持在一定水平。每使用十次最好将缓冲液弃去。 电泳槽两侧的缓冲液面应保持同一水平面，否则通过薄膜时有虹吸现象，将会影响蛋白质分子的电泳速度 电泳失败的原因: 电泳图不完整;蛋白组分分离不佳；染色后蛋白质中间着色浅；薄膜透明不完全；透明膜上有气泡。,血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳,15,临床意义,血清蛋白通过醋酸纤维素薄膜电泳，通常可以分离得到（Alb）、 、 、-球蛋白。正常人血清中各种蛋白组分的浓度差别较大，所以在许多病理情况系会发生细微的变化，往往没有特意的临床诊断价值。分析各种疾病的电泳分析结果，可看出显著变化。,血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳,16,血浆蛋白是血
9、浆中最主要的固体成分,含量为6080g/L ,绝大部分由肝脏合成,仅球蛋白由浆细胞合成正常值: 白蛋白57%72% 1球蛋白2%5% 2球蛋白4%9% 球蛋白6.5%12% 球蛋白12%20%,谢谢,血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳,17,血浆蛋白的主要功能: 维持血浆胶体渗透压 调节血浆pH值,维持酸碱平衡 运输营养物质,代谢物,激素,药物及金属离子等 免疫作用,血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳,18,血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳在临床上常用于分析血、尿等样品中的蛋白质，供临床上诊断肝、肾等疾病参考。 肝炎:白蛋白,a1-球蛋白,a2-球蛋白,-球蛋白下降,-球蛋白升高 肝硬化:白蛋白,a1-球蛋白,a2-球蛋白下降明显, -球蛋白极度升高 肾病综合症:白蛋白降低,2和球蛋白升高,