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1、核酸分子杂交技术与应用,一、杂交的基本原理,杂交的基本原理是碱基互补的二条单链核酸退火形成双链。用于诊断目的的杂交双方是已知序列的病毒探针和待测样品中的病毒核酸,杂交后通过特定方法检测。如有杂交信号, 则说明样品中存在病毒核酸,进而证明病毒感染的存在。,一、核酸分子杂交的基本原理与分类（一）核酸分子杂交的基本原理1、变性（denaturation）（1）定义： 在一定的条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，双链解链成为单链。,（2）.引起核酸变性的因素,酸 碱,热,变性剂 （尿素）,有机溶剂 （乙醇）,（3）、变性核酸的特点： 粘度下降 沉降速度增加 浮力上升 紫外吸收增加,
2、2、融解温度：定义：在DNA热变性时，其A260的升高达最 大值一半时的温度。,影响Tm的因素： （1） DNA碱基的组成 G-C含量越多 Tm值越高 A-T含量越多 Tm值越低,（2）溶液的离子强度 低离子强度 Tm值越低 高离子强度 Tm值越高,（3）pH值 pH值5-9 Tm值变化不明显 pH11 不利于氢键形成（4）变性剂 干扰碱基堆积力和氢键的形成,3、复性 变性DNA经过一定处理重新形成双螺旋的过程。影响复性速度的因素： DNA浓度 DNA片段的大小 DNA片段复杂性 合适的复性温度 适当的离子强度,4、杂交,定义 两条来源不同，但具有 互补序列的核酸，按碱基配 对原则复性形成一个
3、杂交体， 这个过程即杂交，或称分子 杂交。,分类DNA-DNADNA-RNARNA-RNA,二、核酸探针（一）探针的概念 探针（probe） 指能与特定靶分子发生特异性相互作用，并能被特殊方法所检测的分子。 例如抗原-抗体、生物素-亲和素等均可看成是探针与靶分子的相互作用。基因探针 指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记（同位素或非同位素标记）的核苷酸链。,（二）探针种类和选择1.探针种类（1）基因组DNA探针 为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。（2）cDNA探针 以mRNA为模板经逆转录酶催化产生的互补于mRNA的DNA链。 （3）RNA探针
4、以DNA两条链中的任意一条为模板转录生成RNA。具高杂交效率，但易于降解和标记方法复杂。（4）寡核苷酸探针,2.探针的选择 高度特异性，一般探针越长，杂交作用越强，其专一性也越强。,三、探针标记原理与方法 理想的探针标记物应具备高度的敏感性 标记物与探针结合后，不影响杂交时碱基 配对及探针分子的主要理化性质；检测方法除有高灵敏性、高特异性、假阳 性绿低外，尚需考虑环境污染少，价格低；若用酶促方法标记，应对酶的Km值影响不 大，以保证标记反应的效率和标记产物的 比活性。,（一）、标记物 放射性同位素标记物 非放射同位素标记物,1.放射性同位特点： 放射自显影技术检测，信号的强弱通过 计数银粒的多
5、少易于进行定量分析。主要缺点 射线对人体有伤害 放射性物质需特殊的处理 半衰期短不宜存放使用,2. 非放射性标记物 常用的有地高辛（digoxigenin，Dig）、生物素（biotin）、荧光素。特点： 敏感性不如同位素标记 稳定性和分辨率高 检测时间短 操作简便 不需特殊的防护设备 不存在放射性污染,（二）放射性同位素标记法探针标记法 酶反应法 化学反应法常用标记探针的同位素 32P 3H 35S 131I 125I 14C,全程标记1、随机引物法（random priming） 利用DNA聚合酶来合成与模板互补的新的DNA链。 将6-8寡核苷酸片段与已变性的DNA单链或RNA模板退火，使
6、该片段随机互补结合在单链分子上，在大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段作用下，以同位素标记的dNTP为原料，寡核苷酸为引物的3-OH端开始沿5至3方向，合成一条与模板互补的新DNA链。,2、切口平移法胰DNA酶I在DNA双链上随机切开若干切口， 切口处形成3-OH末端。大肠杆菌DNA聚合酶I以切口处开始作用， 以另一条DNA链为模板。4种三磷酸脱氧核苷酸为原料，沿切口 水解5端核苷酸和3端修复加入标记核苷 酸同时进行，切口平行推移。 生成的两条链都被同位素均匀标记。,大肠杆菌DNA聚合酶I（1）5 3聚合酶活性,（2）3 5外切酶活性,（3）5 3外切酶活性,3、全程RNA探针标记4、化学
7、法全程标记,末端标记法 末端标记法是将标记物导入线型DNA或RNA的5端或3端的一类标记法。 5端标记法 3端标记法,（1）5端标记法（T4噬菌体多苷酸激酶） 用碱性磷酸酶切除DNA双链分子或RNA单链5末端的磷酸基团，使其成为5-OH，然后在（-32P）ATP存在下，经T4噬菌体多苷酸激酶催化，将位上的32P转移到DNA或RNA分子的5-OH末端，使DNA片段或RNA或寡核苷酸5端均带32P标记。,（2）3端标记法（大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段） 大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段有53DNA聚合酶和微弱的35外切酶活性，但无53外切酶活性。对残缺3末端可进行标记。,35k
8、D,76kD,苦草杆菌蛋白酶裂解全酶,5 3外切酶,5 3聚合酶 3 5外切酶,5 3聚合酶 3 5外切酶,Klenow片段,DNA聚合酶I全酶,四、杂交与杂交后检测,（一）核酸分子与固相介质的结合 1、支持介质的类型和性质 硝酸纤维薄膜： 本底低，易检测杂交信号对小于500碱基的 核酸结合力低，脆性大易破裂。 尼龙膜和带电荷的尼龙膜： 耐用，结合力强，但其本底高。,（二）核酸分子的转移,1、噬菌体/克隆的转移,2、从凝胶上转移DNA,（1）毛细转移 （2）真空转移 （3）电转移,（三）核酸的固定,1、烘烤 802小时 2、紫外光固定 3、碱固定,（四）杂交,1、预杂交 （1）目的：减少非特异
9、性杂交 （2）成分： 去污剂：1%SDS （可促进溶液对薄膜的覆盖，可 抑制RNase酶活性） 封闭剂：Denhard氏溶液,2、杂交,影响杂交的因素 （1）影响长探针杂交的因素 1）影响杂交速率和杂化分子稳定性的因素 核酸分子浓度与杂交速率 高浓度双链探针的杂交 碱基组成：探针的Tm高，杂交速率快 盐浓度：离子强度与杂交速率成正比；与杂交稳定性 也成正比。 温度：与杂交速率成正比。 甲醛：可降低Tm值。 错配的核酸序列：错配降低杂交速率。 杂交的加速剂,影响长探针杂交的因素,2）酶联探针 3）杂交反应体积 4）杂交时间,3、洗脱,除去溶液 未反应的探针 与滤膜疏松结合的探针 非特异性结合的探
10、针,（五）杂交信号的检测,放射自显影 非放射性杂化分子的检测,五、分子杂交技术 液相杂交、固相杂交、原位杂交、基因芯片（一）液相分子杂交 将参加液相杂交的两条核酸链都游离在溶液中，在一定条件下（溶液的离子强度、温度、时间等）进行杂交，然后再将未杂交的探针除去，即得到杂交后的核酸分子。,（二）固相分子杂交 将待测的靶核苷酸链预先固定在固体支持物上，而标记的探针则游离在溶液中，进行杂交反应后，使杂交分子留在支持物上，故称固相杂交。其可通过漂洗能将未杂交的游离探针除去，留在膜上的杂交分子容易被检测，能防止靶DNA的自我复性，故被广泛应用。,1、菌落杂交 用于重组细菌克隆筛选的固相杂交。主要步骤： 菌
11、落平板培养 滤膜灭菌后放到细菌平板上 菌落粘到滤膜上 滤膜放到杂交液中 探针杂交 检测,2、 Southern印迹杂交 膜上检测DNA的杂交技术，1975年由Edwin Southern建立。利用这一技术可进行克隆基因DNA的酶切图谱分析，基因组中某一基因的定性与定量分析、基因点突变及限制性片段长度多态性分性等。,3、 Northern印迹杂交 应用DNA探针检测特异mRNA的一种杂交技术，主要用于分析mRNA的转录或mRNA分子大小，其方法类似于Southern印迹杂交。,4、点杂交和狭缝杂交,（三）原位杂交1、定义： 将标记探针与细胞或组织中的核酸按碱基配对原则进行特异性杂交，并应用组织化学或免疫组织化学方法在显微镜下进行细胞内定位或基因表达的检测技术称为原位杂交（hybridization in situ)。2、操作步骤： 载片的清洁与处理 组织与细胞的固定 探针 湿盒,HPV,FISH,（四）基因芯片技术 是集成化的核酸分子杂交技术。,The End,