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1、2.2实验方法2.2.1 a葡萄糖苷酶抑制活性的测定方法2.2.1.1反应溶液的制备（1 ）配制底物PNPG溶液：精确称取 0.3766gPNPG，加适量O.1mol/L磷酸缓冲液（pH为6.8）溶解，再用容量瓶准确定容到 50mL，配制成25mmol/L的母液。将母 液分别稀释成0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mmol/L7个不同梯度的标准品溶液， 备用。（2）配制a葡萄糖苷酶的酶溶液：将冻干酶粉（酶活力为 14u/mg ）用0.01mol/L 磷酸缓冲液（pH为6.8）溶解，配制成2u/mL的母液。再将酶液分别稀释，配制成0.1、 0.2、0.3、0.4、0.5、1.
2、0u/mL 的酶溶液，备用。（3） 配制DNJ标准溶液（抑制剂）：精确称取0.0010g DNJ标准品，用容量瓶准确定容到10mL，配制成1000 pg/mL DNJ标准母液。将母液分别稀释成、1、5、10、 20、40、60用/mL六个不同梯度的标准品溶液，备用。（6） 0.2mol/L的Na2CO3 :称取2.16g Na 2CO3于烧杯中，加入适量蒸馏水溶解，并定容到100mL，4C下保存，备用。2.2.1.2 PNP标准曲线的绘制精确称取0.0278g对硝基酚（PNP），加0.01mol/L磷酸缓冲液（pH为6.8）溶解，再 用容量瓶定容至10mL，即得20mmol/L母液。用蒸馏水将
3、其母液稀释成浓度分别为1、5、 10、20、40、40、80和100 pmol/L的标准溶液。取100 p上述标准液，各加入150此0.2mol/L 的Na2CO3，混匀1 min，再于405 nm处测定其吸光度，得标准曲线方程： y=128.13x+0.3579 (R2 =0.9998)，其中 y 为浓度，x为吸光值221.3 a葡萄糖苷酶抑制活性的测定测定方法参照Masao Hattori等试验条件，并做调整。实验分为空白组、对照组、样品空白组和样品组，各反应物按表中剂量在96孔板中进行加样，每组3个平行。按表依次加入PBS缓冲液、抑制剂溶液和底物，混合均匀，于37 C水浴保温10min，
4、结束后，取出，加入37 C水浴的酶溶液，充分混匀，于 37 C水浴反应20min，结束后加 入150丄0.2mol/L的Na2CO3溶液中止反应。由于 PNPG在a葡萄糖苷酶的作用下能 水解产生葡萄糖和PNP , PNP在405nm处有最大吸收，其测定其吸光度，根据公式便 可计算出各样品a葡萄糖苷酶的抑制率及IC50值。抑制率=仝兰空邑100%AC-Ab公式表4各反应物添加计量和顺序（单位：山）Table 4 The respective reacta nts add measureme nt and seque nee ( Un it:此)试剂空白组对照组样品空白组样品组PBS溶液80706
5、050抑制剂002020PNPG底物20202020充分混匀，37 C下孵化10mi n酶溶液010010充分混匀，37 C下反应20mi n碳酸钠1501501501502.2.2单因素试验设计以底物浓度、酶浓度、酶促反应时间和添加顺序为考察因素，以DNJ的a葡萄糖苷酶抑制率为衡量指标，进行单因素试验。固定反应顺序为抑制剂+酶再加底物、底物浓度为2.0mmol/L，酶浓度0.3u/mL，缓冲液pH为6.80，反应时间为20min。2.221反应物添加顺序分别考察如下三种不同的反应顺序对抑制活性的影响。a、抑制剂+底物t37 C温育10min宀+酶，反应20min宀碳酸钠终止反应 宀测定b、抑
6、制剂+酶t 37 C温育10min t +底物，反应20min t碳酸钠终止反应 t测定c、底物+酶t 37 C温育10min t +抑制剂，反应20min t碳酸钠终止反应 t测定2.2.2.2底物浓度选DNJ和拜唐苹为抑制剂，以其a葡萄糖苷酶抑制率为指标，考察0.5、1.0、2.0、 4.0、5.0mmol/L这5个不同梯度的底物对抑制活性的影响。2.2.2.3酶浓度选DNJ和拜唐苹为抑制剂，以其a葡萄糖苷酶抑制率为指标，考察0.1、0.3、0.5、 0.7、0.9u/mL5个不同浓度的酶对抑制活性的影响。2.224缓冲液pH选DNJ和拜唐苹为抑制剂，以其a葡萄糖苷酶抑制率为指标，分别考察
7、不同pH6.6、6.8、7.0、7.2和7.4的缓冲液对抑制活性的影响。2.2.2.5反应时间选DNJ和拜唐苹为抑制剂，以其a葡萄糖苷酶抑制率为指标，考察10、20、30、40和50min不同反应时间对抑制活性的影响。参考文献精品资料1 Ma C M, Hattori M, Da neshtalab M, et al. Chloroge nic acid derivatives with alkyl chai ns of differe ntChem,len gths andorie ntati ons:pote nt alpha-glucosidasein hibitorsJ.J Med2008,51(19):6188-6194.精品资料Welcome ToDownload !欢迎您的下载，资料仅供参考！精品资料