《TALEN原理.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《TALEN原理.pdf（2页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、TALENTALEN 原理原理 标签： 发布时间：2013-02-24 TALE 原理 AL 的核酸识别单位为重复 34 个恒定氨基酸序列，其中的 12、13 位点双连氨基 酸与 A、G、C、T 有恒定的对应关系，即 NG 识别 T，HD 识别 C，NI 识别 A，NN 识别 G。为获得识别某一特定核酸序列的 TALE，只须按照 DNA 序列将相应 TAL 单元串联克隆即可。由于物种基因组大小的不同，选择 的特异序列长度也不同， 对于哺乳类动物包括人类，一般选取 16-20bp 的 DNA 序列作为识别靶点。 组成的 TALE 识别模块与核酸酶或转录激活因子相连， 导入细胞即可实现基因敲除或激
2、 活。 TALEN 基因敲除原理 将识别特异 DNA 序列的 TALE 与内切核酸酶 FokI 偶联,可构建成剪切特异 DNA 序 列的内切酶 TALEN。而且FokI 需形成 2 聚体方能发挥活 性，大大减少了随意剪 切的几率。 在实际操作中，需在目标基因的编码区或外显子和内显子的交界处选 择两处相邻（间隔 13-22 碱基）的靶序列（一般 16-20 个碱基）分别进行 TAL 识别模块构建。 将这两个相邻靶点识别模块（分别）融合克隆到 FokI 的 N-末 端，形成真核表达载体，得到 TALEN 质粒对。 将 TALEN 质粒对共转入细胞中可实现靶基因敲除。TALEN 质粒对共转入细胞后， 表达的融合蛋白，分别与靶位点特异结合， 由于两个 TALEN 融合蛋白中的 FokI 临近， 形成二 聚体，发挥非特异性内切酶活性，在两个靶位点之间剪切 DNA， 形成 DSB （Double-Strand Breaks） ,诱发 DNA 损伤修复机制。 细胞可以通过 NHEJ （Non-homologous End Joining）修复 DNA， 在此修过程中或多或少地删除或 插入了一定数目的碱基，造成移码，形成目标基因敲除突变体。