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1、生物化学蛋白质共价结构,第四章蛋白质的共价结构,生物化学蛋白质共价结构,一、蛋白质(protein)通论,蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质,生物化学蛋白质共价结构,（一）蛋白质的化学组成和分类,1、蛋白质的元素组成与糖和脂类不同，除含有C、H、O外，还有N和少量的S、P。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是Fe、Cu、Co、Mn、 Zn等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为： 碳 50 氢 7 氧 23 氮 16% 硫 0-3 其他 微 量,生物化学蛋白质共价结构,2、蛋白质的含氮量,蛋白质的含氮量接
2、近于16%，所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量： 蛋白质含量=每克生物样品中含氮的克数 6.25蛋白中的氮占生物组织中所有含氮物质的绝大部分。因此，可以将生物组织的含氮量近似地看作蛋白质的含氮量。,生物化学蛋白质共价结构,凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定再以标准酸碱滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。,Degradation: Pr
3、otein + H2SO4 (NH4)2SO4 + CO2 + SO2 + H2OLiberation of ammonia: (NH4)2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2H2O + 2NH3 2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O Titration: (NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O (NH4)2SO4+4H3BO3 (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O 2NH4Cl+4H3BO3,生物化学蛋白质共价结构,二、蛋白质的分类按照组成分类,单纯蛋白质：蛋白仅由氨基酸组成，单纯蛋白可根据其物理性质如溶解度分类：清蛋白、球蛋白、组蛋白等；缀合蛋白质：除了氨
4、基酸以外，蛋白质上还存在其他化学成分作为其结构的一部分。其中非蛋白部分称为辅基。缀合蛋白可根据其辅基进行分类：糖蛋白、脂蛋白、血红素蛋白；,氨基酸残基数=蛋白分子量/110,对不含辅基的简单蛋白而言：,生物化学蛋白质共价结构,纤维状蛋白,球状蛋白,膜蛋白,蛋白质的分类按蛋白形状和溶解度分类：,生物化学蛋白质共价结构,蛋白质的分类按功能分类：,酶、转运蛋白、调节蛋白、贮存蛋白、受体蛋白、结构蛋白、运动蛋白等。,生物化学蛋白质共价结构,肌红蛋白（一条多肽链+血红素辅基）单体蛋白质,血红蛋白（4条多肽链+铁原子的环状血红素辅基）寡聚/多聚蛋白质,蛋白质的分类按肽链组成,生物化学蛋白质共价结构,（二）
5、蛋白质的构象和蛋白质结构的组织层次,蛋白质是相对分子量很大的生物分子， 每一种天然蛋白质都有自己特有的空间结构或称三维结构，这种三维结构通常被称为蛋白质的构象。为了表示蛋白质结构的不同组织层次，一般采用下列术语： Protein的一级结构（primary structure) Protein的二级结构（secondary structure) Protein的三级结构 （tertiary structure) Protein的四级结构（quarternary structure),生物化学蛋白质共价结构,一级结构：多肽链氨基酸序列,二级结构：-螺旋和-折叠,三级结构：具有特定走向的三维结构,四
6、级结构：各亚基在空间上的组合,蛋白结构的组织层次,氢键、离子键、范德华力、疏水作用,生物化学蛋白质共价结构,肽键(peptide bond) Amino acid 的连接方式， 实验根据：p163Amino acid 通过肽键连接起来的化合物称为肽 (peptide)除了共价肽键，还存在二硫键。,二、多 肽 （一）肽&肽键,生物化学蛋白质共价结构,肽的分类：二肽、寡肽和多肽，组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基；具有一个游离的氨基末段（-NH2）和羧基末端（-COOH），有时可成环为环状肽。肽链具有方向性 （N-C），命名：“某氨基酰某氨基酰 某氨基酸”例如下图所示的 丝氨酰缬氨酰酪氨酰
7、天冬氨酰谷氨酰胺氨基酸二硫键: 链内二硫键和链间二硫键,Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,Gln-Asp-Tyr-Val-Ser,X,生物化学蛋白质共价结构,肽的酸碱性质主要决定于肽键中游离末端-NH2、游离-COOH以及侧链R基上的可解离功能团。肽的游离末端-NH2也可以与茚三酮发生定量反应生成紫色；双缩脲反应为肽和蛋白质所特有，游离氨基酸没有该反应。反应原理：在碱性溶液中蛋白质（2个以上肽键）与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关，因此被广泛地应用。,（二）肽的物理化学性质,生物化学蛋白质共价结构,双缩脲,双缩脲络合物,多肽,
8、双缩脲似络合物,借助分光光度计，可测定蛋白质含量,生物化学蛋白质共价结构,（三）天然存在的重要多肽脑啡肽,多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。除了蛋白水解可产生多肽外，生物体内有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在，这类多肽通常都具有特殊的生理功能，称为活性肽。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。,脑啡肽,脑啡肽（enkephalin），神经递质的一种。又被称为“脑内吗啡”，对脑细胞具有独特的作用，能够激活处于抑制沉睡状态的脑细胞，对因脑损伤导致的后遗症有很好的恢复作用。,Tyr-Gly-Gly-Phe-Met,生物化学蛋白质共价结构,短杆菌肽S (环十肽)194
9、4年从短芽孢杆菌培养液中分离，含有L-氨基酸、D-氨基酸和一些不常见氨基酸，如鸟氨酸（Ornithine, 缩写为 Orn）。主要抗革兰氏阳性菌，对耐青霉素G的金葡菌亦有作用。临床上局部用于治疗及预防化脓性病症。,天然存在的重要多肽-短杆菌肽S,生物化学蛋白质共价结构,谷胱甘肽是属于含有巯基的、小分子肽类物质，具有重要的抗氧化作用和整合解毒作用。谷胱甘肽有还原型（G-SH）和氧化型（G-S-S-G）两种形式，在生理条件下以还原型谷胱甘肽占绝大多数。谷胱甘肽还原酶催化两型间的互变。半胱氨酸上的巯基为其活性基团（故谷胱甘肽常简写为G-SH），易与碘乙酸、芥子气、铅、汞、砷等重金属盐络合，而具有了整
10、合解毒作用。参与细胞内氧化还原过程，作为某些氧化还原酶的辅因子，清除内源性过氧化物和自由基，防止过氧化物积累，维护巯基酶活性中心的巯基处于还原状态。,天然存在的重要多肽-谷胱甘肽,生物化学蛋白质共价结构,三、蛋白质的一级结构测定,蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年 F. Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有100,000多个不同蛋白质的一级结构被测定，其中相当多蛋白应用了Sanger测序原理测定的。定义： Protein的一级结构是指构成蛋白质的各种氨基酸的种类、数量、连接方式 和排列顺序，由遗传信息（遗传密码）所决定。涉及的化学键是肽键和少量的二硫键。
11、,蛋白质一级结构的内容：组成蛋白质的多肽链数目多肽链的氨基酸顺序多肽链内或链间二硫键的数目和位置,生物化学蛋白质共价结构,1. 蛋白质的一级结构测定策略,生物化学蛋白质共价结构,1. 蛋白质的一级结构测定步骤,测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质的相对分子量比较,生物化学蛋白质共价结构,8mol/L尿素或者6mol/L盐酸胍或者高盐处理,生物化学蛋白质共价结构,8mol/L尿素或者6mol/L盐酸胍存在下，过量的-巯基乙醇还原二硫键为巯基,酸水解及碱水解、层析及质谱等确定肽链中各种氨基酸出现种类及频率,生物化学蛋白质共价结构,N-端：二硝基氟苯法丹磺酰氯法苯异硫氰酸酯法氨肽酶法,C-端：肼解法还
12、原法羧肽酶法,二硝基氟苯法,层析、色谱、质谱鉴定,（1）二硝基氟苯(DNFB/FDNB)：-NH2上的烃基化反应,黄色,生物化学蛋白质共价结构,（2）丹磺酰氯(DNS)法-NH2的酰基化反应,层析、色谱、质谱鉴定,荧光更灵敏,生物化学蛋白质共价结构,(3) 苯异硫氰酸酯（PITC）法,苯乙内酰硫脲衍生物,剩下的完整肽段，可继续此反应进行多肽测序,层析、色谱、质谱鉴定,PTC 多肽,生物化学蛋白质共价结构,(4) 氨肽酶法,概念：氨肽酶是一类肽链外切酶，能够从多肽链的N-末端逐个向里切，释放出氨基酸。原理：根据不同反应时间所释放的氨基酸种类和数量，对反应时间做动力学曲线，推断蛋白质N-端残基。不
13、足：不同氨肽酶对肽键敏感程度不一样，有时难以判断哪个残基在前面。优点：当肽段的N端氨基酸被封闭，例如环化的短杆菌肽S，就无法利用游离-NH2与二硝基氟苯、丹磺酰氯、PITC的反应。,焦谷氨酸氨肽酶,生物化学蛋白质共价结构,C-末端氨基酸鉴定肼解法,FDNB、DNS法、层析、色谱、质谱鉴定,蛋白质或多肽与无水肼加热发生肼解，反应中除了C端氨基酸以游离形式存在外，其他的氨基酸都转变成相应的氨基酸酰肼化物。肼解法是测定C末端残基最重要的化学方法。肼解过程中，Asn、Gln和Cys等被破坏，C末端Arg变成鸟氨酸,与苯甲醛作用成水不溶性沉淀,氨基酸酰肼 游离氨基酸,生物化学蛋白质共价结构,C-末端氨基
14、酸鉴定还原法,肽链C末端AA,-氨基醇 + 氨基酸,层析、HPLC、质谱等鉴定,水解,生物化学蛋白质共价结构,C-末端氨基酸鉴定羧肽酶法,概念：一类肽链外切酶，专一地从肽链的羧基端开始逐个降解，释放出游离氨基酸，被释放氨基酸量对反应时间做动力学曲线，判断C端氨基酸序列。方法：常用4种羧肽酶对多肽进行处理。例如，羧肽酶A能释放除Pro、Arg、Lys之外的C末端残基；羧肽酶B则只水解Arg、Lys为C末端的肽键。A+B则可以释放除Pro之外的任意C端aa残基；羧肽酶Y则可以作用于任何一个C末端残基。,生物化学蛋白质共价结构,当几条多肽链通过二硫键交联在一起时，用8mol/L尿素或6mol/L盐酸
15、胍使蛋白变性，暴露出分子内部的S-S键；过甲酸氧化法和巯基化合物还原法打开二硫键 ；用烷基化试剂，如碘乙酸，保护生成的巯基，以防止它重新被氧化；,生物化学蛋白质共价结构,酸水解碱水解,1. 酸水解常用6mol/L的盐酸或4 mol/L的硫酸在105-110条件下进行水解，反应时间约20小时；此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化。缺点是色氨酸被沸酸完全破坏；含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；门冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基。,生物化学蛋白质共价结构,2、碱水解,一般用5 mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时；由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高；部
16、分的水解产物发生消旋化；该法的优点是色氨酸在水解中不受破坏。,生物化学蛋白质共价结构,水解后的氨基酸组成分析,生物化学蛋白质共价结构,化学裂解法溴化氰： Met-X羟胺 NH2OH：Asn-Gly,Edman测序可以连续降解几十个氨基酸，但是天然蛋白长度多在100个氨基酸残基以上，因此必须把蛋白分子用蛋白酶水解或者化学裂解成小的肽段。,生物化学蛋白质共价结构,A.溴化氰断裂：Met-X,p129,断裂由甲硫氨酸残基（Met）的羧基参加形成的肽键。蛋白中甲硫氨酸含量少，所以可以产生不多的肽链。,生物化学蛋白质共价结构,B.羟胺断裂：Asn-Gly,NH2OH在pH 9时能够专一性断裂Asn-Gl
17、y 之间的肽键，Asn-Leu和Asn-Ala之间的键也能断开。,生物化学蛋白质共价结构,2. 蛋白酶裂解法,概念：用于肽链裂解的蛋白水解酶，例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶等。这些蛋白酶都是从肽链内部进行裂解，又称内肽酶。每种酶有不同的专一性酶切位点：,生物化学蛋白质共价结构,生物化学蛋白质共价结构,生物化学蛋白质共价结构,N-端分析法（Edman降解）能够不断重复循环，将N端氨基酸逐个标记和解离，已有机械化的蛋白质测序仪B. 氨肽酶或羧肽酶法从肽链的N-末端或者C-末端逐个向里切，绘制水解时间与释放氨基酸的量来确定肽链的氨基酸组成。但是局限性大，只适合检测末端几个氨基酸C
18、. 质谱用样品量少，灵敏度高，速度快，是主流,生物化学蛋白质共价结构,苯异硫氰酸酯法,已自动化-氨基酸测序仪,水解、分离氨基酸,二硝基氟苯,二硝基苯基谷氨酸,还原二硫键,E（Glu）是氨基酸的N末端,用胰蛋白酶酶解、分离片段、Edman测序,用溴化氰裂解、分离片段、Edman测序,拼接序列,N 端,C端,含有38个氨基酸残基；如果用Trysin酶解，可产生4个肽段；用溴化氰裂解产生3个肽段。,T-2是N末端，因为其末端为Glu(E);T-3是C末端，因为其不以Arg(R)、Lys(K)结尾,C-3与T-1和T-4都重叠,生物化学蛋白质共价结构,生物化学蛋白质共价结构,生物化学蛋白质共价结构,用
19、特异性低的蛋白酶，例如胃蛋白酶， 水解蛋白质成小片段的肽段对角线电泳样品点在滤纸中央一向电泳用过甲酸蒸气断裂二硫键旋转90度，进行第二向电泳茚三酮显色常规肽段在对角线上含硫磺基丙氨酸肽段偏离对角线对含有硫磺基丙氨酸肽段进行序列分析,生物化学蛋白质共价结构,四、蛋白质的氨基酸序列与生物学功能,（一）同源蛋白质的物种差异与生物进化,（1）同源蛋白质：在不同生物中行使相同或相似生物学功能的蛋白质称同源蛋白质，例如血红蛋白。其氨基酸序列具有明显的相似性，即同源性。同源蛋白具有一个进化祖先。（2）同源蛋白质的某些位置的氨基酸残基在已研究过的物种中都是相同的，这些氨基酸残基成为不变残基；其他在不同物种中变
20、化大的则称为可变残基。,含有血红素的细胞色素c,生物化学蛋白质共价结构,细胞色素c及其系统进化树：对40多种物种中的细胞色素C氨基酸序列分析，其多肽链中28个氨基酸残基在所有分析过的样品中都是保守的。第70-80间的保守氨基酸是成串存在。可变残基可能是填充或者间隔的区域，其变化不会影响蛋白质的功能；任两个物种间细胞色素c的氨基酸差异数目越多，进化上相距越远。,生物化学蛋白质共价结构,四、蛋白质的氨基酸序列与生物学功能,C protein in Salmonella enterica MSKLVQAYDLAEYEDFINQEQFAGRPLAEYVAEVQRIYCADKRPWVIGYSGGKDSS
21、AVITLVYLALLGLPPEMRSKDVFIVSSDTLVETPVVVDLIKKTMLQIEAGAKRNGLPITQHAVTPKTNETFWVNLLGKGYPAPTRSFRWCTERMKINPVSDFIKDKVSQFDEVIVVLGSRSSESASRAQVIAKHKIDGSRLARHTTLANAFIYTPIDTWDVEDVWKLLRGAFRYAPEDIDEWESPWGGNNRPLWTLYMDSSAQGECPLVIDESTPSCGNSRFGCWTCTVVTKDKAMESLIKNGEEWMSPLLKYRDLLAFTTDPANKDTYRNYKRRTGKVSYQYAKDGEDRSAERKHVPGP
22、YWLKYRQQWLKDLLEIERDLNAQGHTITLITQPELHAIRQEWLKDPNEPDWHDTLPEIYREVYQQDLNWVVDDQSRFDASDADLLAQITQGFDVVPEMVMKLIELETSMEGLSRRQGIFDKLGTILKQDWGSLEEIQQQQATLQKRNDRDIHQDEVEKLEAELQTLQRRIIDAGESSVLIDEENERAH,1. 蛋白保守结构域鉴定,生物化学蛋白质共价结构,2. 寻找Database中同源性蛋白,生物化学蛋白质共价结构,3. 基于氨基酸序列的进化分析,生物化学蛋白质共价结构,缩合剂,除去保护基,(保护基),(保护基),保护基条
23、件：接肽的时候起保护作用，接肽完成后又容易除去，不引起肽链断裂,肽和蛋白质的人工合成,氨基保护基 Y： 羧基保护基 Z：,叔丁氧甲酰基,苄氧甲酰基,对甲苯磺酰基,叔丁酯,苄酯,钠盐、钾盐、三乙胺盐等,生物化学蛋白质共价结构,1963年，R.B.Merrifield创立了将氨基酸的C末端固定在不溶性树脂上，然后在此树脂上依次缩合氨基酸，延长肽链、合成蛋白质的固相合成法。在固相法中，每步反应后只需简单地洗涤树脂，便可达到纯化目的。克服了液相合成法中的每一步产物都需纯化的困难，为自动化合成肽奠定了基础。为此，Merrifield获得1984年诺贝尔化学奖。固相法得到了很大发展，除了Merrifield所建立的Boc法(Boc：叔丁氧羰基)之外，又发展了Fmoc固相法(Fmoc:9-芴甲氧羰基）,多肽的固相合成,