免疫试验报告王鹏.doc

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1、北京农学院研究生课程论文成绩:Beijing University of Agriculture高级免疫学课程实验学生姓名王鹏学 号 201030311009系别动物科学技术学院专业基础兽医学任课教师李焕荣副教授2011年06月01日多克隆抗体的制备、蛋白质粗提及鉴定实验一 多克隆抗体的制备一 实验目的1加深对抗体基本知识的了解。2. 了解多克隆抗体的制备方法。二 实验原理1. 抗原注入家兔体内后，由于是外源大分子物质，将充当抗原刺激免疫系统，由B 细胞产生多克隆抗体。在实验中，抗原的纯度越高，越有利于实验。如果抗原 同免疫佐剂一同注入， 佐剂将加强抗原的刺激效果， 使家兔表达更多的抗体， 其

2、 血清中的抗体浓度也会明显升高。 佐剂分为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂， 本 次实验采用弗氏不完全佐剂，由羊毛脂与液体石蜡以1：1 混合，再与抗原溶液以1:1混合，研磨后形成“油包水”剂，抗原浓度为1mg/ml，每次注入1ml。佐剂组与非佐剂组血清抗体效价的差别可以用 ELISA 检出。2. 双向免疫扩散实验原理可溶性抗原与相应抗体在含适量电解质的琼脂凝胶层中从两个孔中向四周 扩散，若两者分子比例适当， 则在扩散的一定时间后在两孔之间相遇并生成白色 沉淀线。观察该白线出现的最大稀释倍数即是抗体的效价。3. ELISA 原理（免疫酶链反应吸附实验）该技术属于免疫酶技术。 酶免疫技术是利用抗原抗体

3、反应的高度特异性和酶 对底物高效催化性， 将抗原或抗体吸附于固相载体表面， 通过底物的显色反应鉴 定抗原抗体结合的反应。ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原 或抗体的 酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性， 酶标记的抗原 或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。4. 抗原和抗体在体内外均可以发生特异性结合，在体外特异性结合后可出现用 肉眼或仪器鉴定的现象，并根据结果对样品中的抗原或抗体能进行定性、定量、 定位的检测。在进行抗原抗体反应时，多采用人或动物的血清作为抗体来源。蛋白质抗原一般要求相对分子质量约在 1 0000以上。一般而言，相对分子质 量越大，结构越复杂，

4、免疫原性越强。 BSA的分子量约为67kDa,本实验以它 为载体，与半抗原 Hb 和 Dx 偶联，可作为抗原刺激机体产生免疫应答。为获得 高质量的免疫血清通常使用免疫佐剂， 它可增强抗原的免疫原型， 延长其在体内 的存留时间， 使初次反应和二次反应融合在一起， 使机体的抗体水平持续上升达 到理想效果。三 实验材料1 实验动物12周龄家兔（2.0kg左右）2主要仪器高速低温离心机酶标仪3试剂弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂HRP标记羊抗兔二抗1%明胶免疫原（Hb-BSA、Dx-BSA ）、包被原（Hb-OVA、Dx-OVA ）。4主要溶液配制包被液（0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐缓冲液）

5、：准确称取NazCOs 1.59 g ,NaHCOs2.93 g,溶于950 mL的蒸馏水中，调pH值为9.6,定容到1 L。0.01 mol/L PBS （pH 7.4）:NaCl8 gKH2PO40.2 gNa2HPO4 （无水）2.13 gKCl0.2 g37C加热溶解后，定容至1000 mL, 121C高压灭菌。洗涤液（0.01 mol/L pH 7.4 的 PBST 溶液）：1 L PBS 中加入 0.5 mL Tween-20。封闭液（血清稀释液）：于PBST中加入明胶至终浓度为1%。终止液（2 mol/L H2SO4）:分别取蒸馏水177.8 mL和浓硫酸22.2 mL混和即可。

6、0.1mol/l pH6.0 磷酸盐缓冲液（PB）:称取 N&HPO4 2HO 1.09g, NaHzPO "O6.05g,蒸馏水溶解后定容至500ml, 4C贮存备用。TMB贮液：称取TMB10mg溶于10ml二甲基亚砜中，4C避光贮存备用。TMB应用液（底物）:1ml的0.1mol/l pH6.0磷酸盐缓冲液，1007的TMB贮液加 15.l的30%H2O2,先用现配。饱和硫酸铵（SAS :查硫酸铵饱和度表，配置不同饱和度的硫酸铵，热至5060C保温数分钟，趁热滤去沉淀，再在 0C或25C下平衡12天。四 试验步骤 1 针对 Hb-BSA 和 Dx-OVA 的多克隆抗体的

7、制备5 周龄大耳白兔， Hb-BSA 和 Hb-BSA 分别用无菌生理盐水配成 2mg/ml 溶 液。取上述溶液和等量的福氏完全佐剂混合并充分乳化后作为免疫抗原， 试验组 每只每次注射 1ml 乳化好的抗原，首次颈背部多点皮内免疫。第二次以 BSA 溶 液和等量福氏不完全佐剂混合并充分乳化作为免疫抗原皮下免疫一次。第 2 次免疫 7d 后耳缘颈脉采血，间接 ELISA 方法检测效价，若没达到要求则重复一次第 2 次免疫操作； 若达到要求， 则以 0.1mg/ml 的 1ml Hb-BSA 或 Dx-BSA 溶液（不 加佐剂）皮下加强免疫，分三次注射，每次间隔 15mi n。一周后心脏采血，分离

8、 血清，4 C保存备用。2 间接 ELISA 方法检测多抗效价将抗血清从 1 ： 1 00倍比稀释至 1 ：6400检测其效价。 ELISA 操作步骤：1）将Hb-OVA和Dx-OVA用pH7.4 0.01mol/L PBS缓冲液稀释分别为最佳包被浓 度，包被酶标条，4C湿盒24h。2）0.05%Tween-20pH7.4 0.01mol/L PBS清洗 3 次，每次 3min，加入 10mg/ml 明 胶封闭液，37r湿盒2h。3）洗涤同上，加入抗体的不同稀释液同时设空白对照，阴性对照；37C湿盒1h。4）洗涤同上，加入HRP标记SPA工作液；37C湿盒1h。5）洗涤同上，加入四甲基联苯胺（

9、TMB）底物显色30min后50卩l 2mol/L H2SO4 终止反应。6）用酶标仪于 450nm 比色。7）稀释液为空白对照，以 A450 值大于或等于空白对照值 2 倍为阳性判定标准。3 琼脂扩散测效价将 1mg/mlHb-OVA 做 100 倍稀释， Dx-OVA 做 200 倍稀释，相应抗血清从 1:2 倍比稀释至 1:32 检测其效价，步骤如下：1）平皿中缓慢加入热融化的琼脂胶，厚度 3mm。2）待凝胶冷却后在其上打孔，孔径3-5mm，孔距4-7mm,中间一孔，周围6 孔, 打完孔后用针头挑出孔内琼脂，用酒精灯火焰封底。3) 加样，与中心孔加入稀释抗原，周围1-5孔加入稀释抗原，6

10、孔加入阳性血清。4) 加样后将平皿置于搪瓷盒中，保持一定湿度，置室温48h判定结果。五试验结果1琼脂扩散试验效价没有可看见白色的沉淀带。2 ELISA抗血清效价ELISA抗血清效价测定结果详见表1，结果显示制备的抗Hb-BSA(Dx-BSA) 多克隆抗体效价。表1第一次间接ELISA测定BSA-HB多克隆抗体的效价稀释度1:1001:2001:4001:8001:16001:32001:6400空白OD值0.8130.6550.4480.2920.2120.1780.1420.128表2第二1次间接ELISA测定BSA-HB多克隆抗体的效价稀释度1:1001:2001:4001:8001:16

11、001:32001:6400空白OD值1.9131.9361.6551.4770.8940.6420.4230.089六讨论1. 将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结 和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易 代谢，可溶性的抗原。首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的 浓度维持在一个较低的水平，在大约 10天左右抗体的滴度会达到最大值。但同 种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同， 和初次免疫应答相比抗体的 合成速度明显增加并且保留时间也长。免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是

12、免疫应答的一个重要特点。三次或以后的抗原注射所产生的应答 和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了 改变，这种改变被称为免疫应答的成熟， 具有重要的实际意义。通常在抗原注射 4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。2在第三次免疫后二周，用间接ELISA方法检测多克隆抗体效价，琼脂扩散 试验测多克隆抗体效价，间接ELISA方法检测结果显示出经过三次免疫接种后， 这只兔子血清抗体已经转阳，且效价较高，但未能达到制备高兔血清的要求， 需 要做第四次免疫。而琼脂扩散试验呈阴性，可能是中心孔到四周孔之间的距离过 远，抗原抗体未能特异性结合，没有产生肉眼可见的白色沉淀线。3 在第

13、四次免疫接种后三周，用间接 ELISA 方法检测多克隆抗体效价，结果 显示血清抗体效价很高， 达到制备多克隆抗体的目的， 再用水剂加强免疫一次后， 心脏采血，制备血清准备做下一步提取鉴定实验用。实验二 硫酸铵沉淀法粗提抗体蛋白一 实验目的1熟悉多克隆抗体蛋白粗提的方法流程。2. 理解硫酸铵沉淀法粗提蛋白的原理。二 实验原理硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可 以将主要的免疫球从样品中分离， 是免疫球蛋白分离的常用方法。 高浓度的盐离 子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子， 从而破坏蛋白质表面的水化膜， 降低 其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。 各种蛋白质的溶解度不同，

14、 因而可利用不同 浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。 这种方法称之为盐析。 盐浓度通常用饱和度 来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。以抗原免疫动物来制备的抗血清是一个非常复杂的混合物， 包括血清的全部 成分。但是同抗原特异性结合的抗体则主要是血清中的免疫球蛋白组分。 通常用 于制备酶标抗体或荧光抗体的免疫球蛋白必须高度纯化并具有特异性， 不应含有 非抗体的血清蛋白。 因此，为了浓缩和提高抗体的效价， 或为制备免疫球蛋白特 异性抗体时，通常也需要分离和纯化免疫球蛋白。 丫球蛋白（IgG）是血清免疫 球蛋白的主要成分， 约占全部免疫球蛋白的 75%，因此，抗体的分离纯

15、化主要是 分离纯化 IgG。三 实验材料1 主要仪器高速低温离心机磁力搅拌器2 实验材料动物血清透析袋（或玻璃纸）3试剂及配制方法0.01 mol/L PBS（ pH 7.4） :KH2PO40.2 gN&HP04 (无水)2.13 gKCl0.2 g37C加热溶解后，定容至1000 mL, 121C高压灭菌。 硫酸铵饱和溶液硫酸铵 800g850gH20 1 000ml加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28Na0H 调pH 至 7.0(不调 pH 值也可以)。四 试验步骤1、取1ml血清，加生理盐水1ml，再逐滴加入(NH4) 2SO4饱和溶液2ml，使 成50

16、%( NH4)2SO4溶液，边加边搅拌，充分混合后，4C静置3h以上。2、4000r/min 离心 20min,弃上清。3、 于沉淀中加1.5ml生理盐水，使之溶解，再加(NH4)2SO4饱和溶液1ml， 使成33% (NH4) 2SO4溶液，充分混合后，4C静置3h以上。4、 4000r/min离心20min,弃上清，以除去白蛋白。重复步骤 5，23次。5、用 5ml 生理盐水溶解沉淀，装入透析袋。6透析除盐，在常水中透析过夜，再在生理盐水中于 4C透析24h，中间换液数 次。7、收集透析后的蛋白液，-20 C保存。五 实验结果 利用硫酸铵沉淀法粗提蛋白， 达到了初步纯化蛋白的目的， 可以做

17、一步的蛋 白质SDS-PAGE电泳鉴定。六 讨论(一) 实验前要用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。1. 边搅拌边慢慢加(NH4) 2SO4到样品溶液中，使浓度为 0.5:1 (v/v);2. 将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时 或过夜( 4C)；3000 r/s 离心 30 min (4C) ，保留上清液；上清液再加( NH4) 2SO4 到 0.5:1(v/v) ，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS，同前透析，除去硫酸氨；3. 上清液再加(NH4 )SO4到0.5:1 (v/v)，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS， 同前透析，除去( NH4) 2SO4；4. 杂蛋白与欲纯化蛋

18、白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效在该实验中，我们通过硫酸铵沉淀法粗提血清中的免疫球蛋白IgG，达到了预期的实验目标，为下一步进行 SDS-PAGE蛋白质电泳做好准备。实验三 SDS-PAGE蛋白质电泳一实验目的1. 学习SDS-PAGE分离蛋白质的原理；2. 掌握垂直板电泳的操作方法。二实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 （简称Acr）和交联剂N , N-亚甲基双丙烯酰 胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并 以此为支持物进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的 差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成

19、若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质， 蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区 带。SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比 例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电 荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS-PAGE）。由于SDS-PAGE可设法将电泳时蛋白 质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级

20、结构的 蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS-PAGE后，就只出现一条蛋白质区带。SDS-PAGE可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。本实验采 用垂直板状不连续系统。所谓 不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲 液、pH和凝胶孔径等所组成。三实验材料1主要仪器电泳仪，电泳槽，摇床。2实验材料动物血清透析袋（或玻璃纸）3试剂及配制方法5x 样品缓冲液（10ml） :0.6ml 1mol/L 的 Tris-HCI（pH6.8）,5ml 50% 甘油，2ml 10% 的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。可在4C保存数周， 或在一20

21、 C保存数月。凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺 30g, N,N '二甲叉双丙烯酰胺0.8g，加 重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4C保存，一般可放置1个 月。pH8.9分离胶缓冲液:Tris 36.3g，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其 溶解，调pH8.9,定容至100ml，4C保存。pH6.7浓缩胶缓冲液:Tris 5.98g，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其 溶解，调pH6.7,定容至100ml，4C保存。TEMED （四乙基乙二胺）原液10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取T

22、ris 6.0g,甘氨酸28.8g,加蒸馏水约900ml， 调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4C保存，临用前稀释10倍。考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250,溶于200ml蒸馏水中， 慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过 滤。四试验步骤1. 将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddH2O冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干；4 A* P# j2 G: h: G% M' 2 A6 u2. 将两块洗净的玻璃板之间加入Space,装好玻璃板；3. 按如下体积配制12%分离胶5.0 ml，混匀；1_5 w2 n:

23、 FC# c" / ?ddH2O1.675 ml1.5 mol/LTris-HCl （pH=8.8）1.25 ml30%Acr-Bis2.0 ml10%SDS50 ul10%AP50 ul4TEMED2 ulr, Q84. 向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20 min后胶即可聚合；）5. 按如下体积配制5%浓缩胶2.0 ml,混匀；ddH201.44 ml1.0 mol/LTris-HCI pH=6.8252 ul30%Acr-Bis248 ul10%SDS20 ul10%AP20 ul4 q-TEMED2 ul$ r, Q8 l( m/ l; j* * A: A$ ?y

24、6. 将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳；7将蛋白质样品与5X样品缓冲液(20ul + 5ul)在一个Eppendof管中混合。放 入100C加热5- 10min，离心，取上清点样；8. 装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样 20 r1Q4 Y3 p5 e6 03 Y0 9. 稳压90V,待溴酚蓝跑进分离胶时，增大电压至 110V待溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需 45 min1h; & A8 T7 s/ C2 |, y; P7 E9 t& S10. 卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色12 hr；加入脱色液，置于80 rpm 脱色摇床上，每20 min更换

25、一次脱色液(10 ml冰乙酸；45 ml乙醇；45 ml蒸馏 水)至完全脱净，成像即可。M 12345五实验结果120kDa85kDa50kDa35kDa25kDa20kDa图1 : M为蛋白质分子质量标准；1-2为DX-BSA10倍稀释；3-4为Dx-OV A原液；5为阴 性对照。六讨论SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS (十二烷基 硫酸钠）,SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合 SDS的量几 乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关， 因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺 凝胶电泳中的迁移率只与蛋白质分子量的大小有关。在本实验中，我们通过对 Dx-BSAIO倍稀释和Dx-OVA原液进行SDS-PAG电 泳发现Dx-BSA的分子量大小大约为70KDa Dx-OVA的分子量大小大约为30KDq 达到了初步掌握SDS-PAG蛋白质电泳的目的。至于蛋白质的迁移率计算，以及 后续的转印电泳和 Western-Bloting 实验技能还有待于以后实验中进一步掌握。