《慢病毒包装浓缩纯化滴度试验步骤.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《慢病毒包装浓缩纯化滴度试验步骤.doc（9页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、资料收集于网络，如有侵权 请联系网站删除只供学习与交流一、包装细胞 293T 细胞的培养一、 293T 细胞的冻存1. 随着传代的次数增加， 293T 细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞 购进时就进行冻存。2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。3. 倒去细胞上清液，加入 D-Hank's 液洗去残留的培养基。4. 加入 0.25% 的胰酶，消化 10-20s 后倒去。5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。6. 细胞计数。7. 将细胞离心， 1000rpm ， 2min 。8. 根据计数结果加入细胞冻存液 （70% 完全培养基 +2
2、0%FBS+10% DMSO ）重悬细 胞，密度为3X 10 6个/ml。10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。二、293T 细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到 8090% 需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维 持细胞良好的生长状态。2. 消化细胞，方法同上。3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为3 X10 5个/ml。4. 分到 10cm 培养皿中， 10ml/ 皿。三、293T 细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过 50 代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要 丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。2. 打开水浴锅，设置温度为 40 C。3. 查看细胞库记录，
3、根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞 （需戴上棉手套， 防止被冻伤） ， 迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在 12 min 内使细胞溶液完全溶解。4. 将 1ml 细胞溶液加入 9 ml 完全培养基中并混匀后转入 10cm 培养皿。5. 放回37 C、3%CO 2和95%相对湿度的培养箱中培养。6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入 10ml 新鲜培养基。二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定1. 所用病毒检测引物为 WPRE 特异引物，序列如下只供学习与交流资料收集于网络，如有侵权请联系网站删除只供学习与交流cat. no.cat. no.cat. no. 4316844)in 帕*;Tri &
4、#163;luctionSunBio IV VectorPackaging Cell5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer), 5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (reverse primer) and 5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3' (probe)2. TaqMan Un iversal PCR Master Mix (Applied Biosystems 4304437)3. TaqMan DNA Template Reage n
5、t Kit (Applied Biosystems401970)4. TaqMa n RNaseP con trol reage nt (Applied Biosystems用于包装的293T细胞的培养用于包装的293T细胞(ATCC No. CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。任何时候细胞汇合率都不准达 到 100%。慢病毒的包装1. 预先准备3个T150 瓶的293T 细胞，培养基为 DMEM + 10% FBS ，1% Glutamax ， 1% 青霉素-链霉素。2. 将细胞分到12分到12个T150瓶中，每瓶的细胞密度
6、是8 X10 6个。3. 第二天，镜下检查细胞。细胞融合度应大致为30-40% ，分布均匀。4. 转染前1小时，取出细胞板，去除原有细胞培养基，加入20ml的Opti-MEM 培养基，将细胞送回培养箱。5. 取两支无菌的 50ml离心管，其中一支中加入 252 卩g pNLEGFP/CMV/WPREDU3载体质粒，168卩g pCD/NL -BH*DDD 包装质粒和 84卩g pLTR -G质粒，用Opti-MEM 培养基补齐到 18ml。另一支中加入 500卩l Trans -EZ溶液和17.5 ml Opti-MEM 培 养基，用电动移液器轻轻混匀。将Trans-EZ 稀释液滴加到质粒管中
7、，边加边轻轻晃匀。IN A W .WTfflMfZ C jjTO 祝关键步骤：推荐使用 Qiagen质粒大抽试剂盒或相当的试剂盒所制备的质粒。6. 室温孵育20分钟，使DNA和Trans-EZ 充分结合形成转染复合体。7. 取1支5ml的移液管，将得到的 DNA-Trans-EZ 复合体均匀滴加入到细胞培养板 中，每板3ml。来回晃动培养板，混匀后放回到 5%二氧化碳培养箱。每一皿细胞培养 盘不要超过6盘。8. 6小时后，移去细胞上清，更换为 17ml的DMEM完全培养基。9. 转染后一天观察细胞，所有的细胞应当都是健康的并且密度接近60-80% 。如果所转染质粒带有 GFP荧光，那么这时候可
8、以看到大于95%的细胞都是带有荧光的。10. 将细胞送回培养箱继续培养2天（36-48小时）。在这个过程中，细胞会逐渐融合形成多核体，大多数的细胞依然贴壁。11. 收集所有的上清，分装到 50ml离心管中。12.4 C, 500g离心10分钟，除去脱落的细胞和大的细胞碎片。13.总的上清约为204 ml，用250- ml 0.45 卩m PVD过滤装置过滤。如果发现滤膜 被堵住，表现为过滤速度变慢，更换新的滤器。只供学习与交流慢病毒的浓缩与纯化方法一超速离心沉淀法离心管，用70%乙醇消毒后，放在超净工作台中打开紫1. 取 6 个 Ultra-clear SW28外灯继续消毒30分钟。2. 每个
9、 Ultra-clear SW28 离心管中加入约 32ml 的预先处理的病毒上清液。3. 取一支 10ml 的移液管，吸取 12 ml 20% 的蔗糖溶液。将移液管一直插入到离心管 的底部，缓慢将蔗糖溶液打出 4 ml 。同样地，将剩下 8 ml 的蔗糖溶液分别加入到另两 个离心管中。另取一支干净的移液管，对剩下 3 管进行同样处理。4. 用 PBS 调整各管的重量，使对应的离心管之间的重量相差不超过0.1g 。5. 按次序将所有 6 个离心管放入 Beckman SW28 超速离心转头中。7. 小心将管子从转头中取出。倒掉上清，将离心管倒扣在纸巾上放置10 分钟使剩余的上清流干。吸掉剩余的
10、液滴。在管底应当有可见的沉淀。8. 每管中加入 100ml 不含钙和镁的 PBS 洗下沉淀。9. 将 SW28 超速离心管插入到 50ml 锥底离心管中，盖上盖子。10. 在4 C溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。11.4 C, 500g离心1分钟，使溶液集中于管底。12. 用200卩I移液器轻柔吹打使沉淀重悬。避免产生泡沫。将所有管中的液体集中到 一个 SW28 离心管中。13. 集中后的病毒悬液分装成50卩I每份，保存在成品管中。用碎干冰速冻后储存在-80 C 。方法二 PEG-8000 浓缩法PEG （聚乙二醇）是高分子聚合物，具有高亲水性，在溶液中会吸收大量水分，减少病 毒之间的距离,
11、使病毒与病毒能够很容易的聚合在一起,病毒的相对浓度提高,达到沉 淀浓缩的目的。5X PEG8000+NaCI 配制 称取 NaCI 8.766 g; PEG8000 50g 溶解在 200mI MiIIi-Q 纯水中； 121 摄氏度 30min 湿热灭绝 30min ；保存在 4 C 。1. 使用0.45 ym滤头过滤慢病毒上清液；3. 每2030min 混合一次，共进行 3-5次；4. 4 度放置过夜；5. 4 度, 4000 g ,离心 20min ；6. 吸弃上清,静置管子 1 2 分钟,吸走残余液体；7. 加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；8. 集中后的病毒悬液分装成50卩每份，
12、保存在成品管中。用碎干冰速冻后储存在-80 C病毒滴度的测定稀释计数法滴度单位： TU/ml ，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。”TU”为” transducing units ”的缩写， 中文为 “转导单位 ”，表示可以感染并进入到靶细胞中的 病毒基因组数。第一天 细胞准备将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至 1X 105/ml ,加入96孔板，100卩1/孔,为每个病毒准备10个孔。放入37 C, 5%CO 2培养箱中培养。第二天 加病毒在 EP 管中做 10 倍梯度稀释，连续 10 个稀释度。稀释方法如下：每种病毒准备 10 个1.5ml EP 管，每管加入90卩1培养
13、液，往第一个管中加入10卩1病毒原液，混匀后，吸取101加入第二个管混匀。依此类推，做十个稀释度（1010 -8 ）。吸取 96 孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。并做好标记。第三天 追加培养液在每个孔再加入100卩1完全培养液，利于细胞的生长。第五天 观察结果并计算滴度在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为X 和 Y，则滴度（TU/ml ） = （X+Y*10 ） *1000/2/X孔的病毒液的含量（卩）。定量 PCR 法病毒感染1天前，取6孔板接种HOS细胞。每孔细胞为 5X 10 4个。接种细胞 24 小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染
14、时细胞的实际数目， 记为 N 。弃去其他培养板中的培养基，更换为含有 5卩g/ml polybrene 的新鲜培养基。将浓缩病 毒用培养基稀释200倍，也就是取1卩1病毒加入到199卩1的培养基中。在3个培养孔 中分别加入0.5卩1, 51和50 1的稀释病毒。感染开始后20小时，除去培养上清，换为5001含DNasel （Takara Mirus Bio ，终浓度为 10 U/ml） 的新鲜培养基。在 37 C 消化 15 分钟，这一步是要除去残余的质粒DNA 。然后换为 2ml 正常的培养基，继续培养 48 小时。用0.5ml 0.25% 胰酶-EDTA溶液消化细胞，在 37 C放置1分钟
15、。用培养基吹洗下，离心收集细胞。按照DNeasy试剂盒的说明抽提基因组 DNA。每个样品管中加入 200 1 洗脱液洗下 DNA。用DNA定量试剂盒定量(Bio-Rad )。基因组 DNA可以稳定保存在-20 C至少2个月。准备PCR所需的试剂和样品。为病毒序列检测引物配总管I :2 X TaqMan Master Mix25 卩 l X nForward primer (100 pmol ml-1)0.1 卩 l X nReverse primer (100 pmol ml-1)0.1 卩 l X nProbe (100 pmol ml-1)0.1 卩 l X nH2O19.7 卩 l X
16、nn = number of reactions.例如：总反应数为 40 ,将 1ml 2 XTaqMan UniversalPCR Master Mix , 4 卩 l forward primer , 4 卩 l reverse primer , 4 卩 l probe 和 788 卩 l H2O混和。震荡后放在冰上。为人基因组序列检测引物配总管n :2 X TaqMan Master Mix25卩lX n10 X RNaseP primer/probe mix2.5 gX nH2O17.5 gX nn = number of reactions.例如：总反应数为 40 ,将 1ml 2
17、XTaqMan UniversalPCR Master Mix , 100 卩 l 10 X RNaseP primer/probe mix 和 700 卩 l H2O 混和。震 荡后放在冰上。在预冷的96孔PCR板上完成PCR体系建立。从总管I中各取45卩1加入到A-D各行 的孔中，从总管n中各取45 1加入到E-G各行的孔中。分别取5卩1质粒标准品和待测样品基因组DNA加入到A-D行中，每个样品重复1次。另留1个孔加入5 口1的水做为无模板对照(no-template control)。分别取5卩1基因组标准品和待测样品基因组DNA加入到E-G行中，每个样品重复1次。另留1个孔加入5 口1
18、的水做为无模板对照(no-template control)。所使用定量PCR仪为ABI PRISM 7000定量系统。循环条件设定为：50 C 2分钟， 95 C 10分钟，然后是95 C 15秒，60 C 1分钟的40个循环。 数据分析：测得的 DNA 样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定，得到每 基因组整合的病毒拷贝数。滴度( integration units per ml ，IU ml -1 )的计算公式如下：IU ml-1 = (CNX D X1OOO)/V其中： C = 平均每基因组整合的病毒拷贝数N = 感染时细胞的数目(约为 1 X 10 5 )D = 病毒载体的稀
19、释倍数V = 加入的稀释病毒的体积数慢病毒的储存与稀释慢病毒的储存1. 病毒的运输采用干冰保温，收到病毒液后若几天内用于实验，可于4 C保存(于一周内用完)。2. 若病毒量较大，需长期保存。则根据每次实验用量分装后放于-80 C冰箱。一般病毒可以放于-80 C约12个月以上，但若超过6个月后使用，请重新检测病毒滴度。3. 避免反复冻融，否则会降低病毒滴度。每次冻融会降低病毒滴度10% 。慢病毒的稀释需要稀释病毒时，将病毒取出后置于冰上融解，用细胞培养用D-Hank's 、PBS 或培养基稀释到所需浓度后混匀分装后4C保存，并尽快用于实验(于一周内用完)。慢病毒在细胞水平的使用什么是 M
20、OI ？“ MOI为"multiplicity of infection的缩写，中文为 感染复数"或 复感染指数”含义为感染时病毒和细胞数量的比值， 即平均每个细胞感染的病毒活性单位数 ( TU number /cell )。在实验中将某种细胞感染达到 80% 时的 MOI 定义为这种细胞的 MOI 。MOI 与整合事件以及目的基因的表达相关。一定范围内，表达水平和MOI 呈正相关。MOI 取决于多种因素， 如细胞状态， 目的基因的大小与性质， 细胞的感染效率等。 所以， 实验前需查阅相关文献，确定慢病毒对目的细胞的亲嗜性、 MOI 以及在体( in vivo ) 注射所需
21、病毒量。若无文献支持，可以通过预实验得到合适的MOI 。实际上，即使有文献支持， 但由于所用细胞代数、 细胞状态以及目的基因的差异， 实际的 MOI 和文献报道 也会不同，所以要安排预实验以确定所需 MOI 以及病毒对细胞生长的影响。目的细胞感染预实验及实验体系的放大实验目的：确定细胞感染所需的MOI，以及是否需要添加感染增强剂Polybrene 。实验材料：96孔板，1.5ml EP管，长势良好的目的细胞一瓶，已知滴度的慢病毒溶液，Polybre ne（ 10mg/ml ），目的细胞培养基等。第一天：细胞准备将长势良好的目的细胞接种到96板，消化好细胞（悬浮细胞不需要消化，直接离心收集细胞后
22、加新鲜培养基重悬即可）后把浓度调为3X 10 45 X10 4个/ml ,按90卩l/孔加入。接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染时细 胞汇合率介于3050% 之间。第二天：病毒感染感染实验分两组，一组直接添加病毒液，一组同时添加Polybre ne 。病毒稀释方法同病毒滴度测定时方法，10倍倍比稀释，共三个稀释度，MOI值依次为100 , 10和1 （细胞经过一天的生长数量约为1X 104个/孔，对应的病毒数量为1X 10 6TU、1 X105TU和1 X104TU）。每个MOI值加两个孔，取出一组加入感染增强剂，比例为1 : 2000，终浓度为5卩g/ml。
23、第二天：换液感染实验同一天，8-12小时后，弃去上清液，更换为新鲜培养基，100卩l/孔。第五天：观察荧光表达情况在倒置荧光显微镜下观察荧光，估计慢病毒感染目的细胞的效率。对于生长缓慢的细胞，可以适当推迟观察的时间，中途可以传代和换液，以保持细胞良好的生长状态。通过细 胞感染的效果，确认目的细胞的感染 MOI以及是否需要添加 Polybrene 。对于因目的基因较大， 载体无法携带标志基因的，可以通过定量PCR来检测目的基因的表达来评估感染效率。实验体系的放大正式实验时，由于细胞数量较大，所需的病毒用量也需相应增大。放大的原则是保持细 胞的密度不变，将培养基体积，病毒量按实际细胞数与预实验细胞
24、数的比例放大。即使 这样，正式实验时由于体系的改变，加上预实验的 MOI值设置跨度较大，可进行对MOI的再次优化。MOI的设置值为预实验最佳值0.5倍，1倍和1.5倍或自己设置合理的数值。表1.病毒感染细胞所用培养基体积和病毒量参考值单孔底面积（cm2 ）正常培养体积（卩）感染时体积（卩lMOI=1 病毒量（TU ）MOI=10 病毒量（TU）MOI=100 病毒 量（TU96孔板0.31001001 X1041 X1041 X10 448孔板0.62002002 X1042 X1052 X10 624孔板1.95005006 X1046 X1056 X10 612孔板3.810005002 X1056 X1066 X10 76孔板9.5200010002 X1052 X1062 X10 7T25瓶25500025005 X1051 15 X10 65 X10 7*表中可培养板底参数数值为CORNING公司产品参数。*对于孔面积较小的培养板，由于溶液张力的关系，培养基体积太少会导致病毒的分布 不均与，所以不做减半处理。