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1、CRBP-1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定 作者：陈波，李建平，戴途，吴志勇，罗蒙，孙勇伟 【摘要】 目的：构建大鼠视黄醇结合蛋白-1(cellular retinol-binding protein- I ，CRBP-1)基因RNAi（RNA interference， RNAi）慢病毒载体。方法：针对已经筛选确定的大鼠CRBP-1 基因RNAi有效靶序列，合成靶序列的Oligo DNA，退火形成双链DNA，与经Hpa I 和Xho I酶切后的pGCL-GFP载体连接产生短发卡RNA慢病毒载体，PCR 筛选阳性克隆，测序鉴定。结果：PCR 鉴定与DNA测序证实合成的含CRBP-1 shR
2、NA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。结论：成功构建大鼠CRBP-1基因RNAi 慢病毒载体。 【关键词】 RNA干扰；视黄醇结合蛋白-1；慢病毒 Abstract Objective：To construct a lentiviral vector of RNA interference（RNAi） of rat cellular retinol-binding protein I (CRBP-I) gene. Methods：The effective sequence of siRNA targeting CRBP-I gene was confirmed in our previous s
3、tudy. The complementary DNA containing both sense and antisense Oligo DNA of the targeting sequence was designed，synthesized and cloned into the pGCL-GFP vector，to construct a lentiviral vector which expressed short hairpin RNA(shRNA)， and it was identified by PCR and DNA sequencing. Results：PCR ide
4、ntification and DNA sequencing demonstrated that insertion of oligonucleotide of the lentivirus RNAi vector containing CRBP-I shRNA was right. Conclusion：The lentivirus RNAi vector of rat CRBP-I was constructed successfully. Key words RNA interference；Cellular retinol-binding protein I；Lentivirus 肝星
5、状细胞（hepatic stellate cells， HSC）的激活过程是肝脏胶原产生和肝纤维化形成的中心环节1，在肝纤维化逆转过程中也起重要作用，2002年Uchio K2在用CCl4制备大鼠肝纤维化模型中发现，活化第5天的HSC中CRBP-1表达明显增加，而视黄醇脂滴消失，提示CRBP-1与肌成纤维样细胞的形成密切相关。近年来，随着RNAi技术的出现，为研究内源性基因功能和信号转导途径提供了强有力的研究工具。我们在已经获取CRBP-1基因的RNAi 有效靶序列的基础上，设计、构建和鉴定表达CRBP-1 shRNA的慢病毒载体，为后期研究CRBP-1 基因在HSC活化中的作用机制和肝纤维化
6、的基因治疗打下基础。 1 材料和方法 1.1 材料 PCR用试剂 primer、dsDNA Oligo （上海吉凯基因技术有限公司合成），大肠杆菌菌株DH5，DMEM，胎牛血清、胰蛋白酶（ Invitrogen 公司）。慢病毒载体系统（ Tronolab 公司www. tronolab. com/ lentivectors.php）. 该病毒包装系统由pGCL-GFP载体，pHelper 1.0(gag/pol 元件)载体，Helper 2.0 (VSVG元件)载体三质粒组成，其中pGCL-GFP载体含有能持续表达小RNA的元件，同时能表达荧光蛋白marker(GFP/RFP)，pHelper
7、 1.0和pHelper 2.0含有病毒包装所必须的元件。 限制性内切酶、T4DNA连接酶（New England Biolabs公司）。 1.2 方法 1.2.1 双链DNA Oligo制备 用Ambion 公司的设计软件，设计、合成3 对针对CRBP-1 基因shRNA的寡核苷酸序列，经分别构建质粒，转染293细胞，据其对CRBP-1 的抑制率，确定有效靶序列：Pscsi-1:CCGCAAGTGCATGACCACA，（CRBP-1 mRNA NM_012733，GenBank GI:77416367）. 设计并合成其shRNA的DNA Oligo：Pscsi495-1：5'- CC
8、GGGACC- CAAGTGCATGACCACACTCGAGTGTGGTCATGCA- CTTGCGGTCTTTTTG-3'，Pscsi495-2：5'- AATTGA- AAAAGACCGCAAGTGCATGACCACACTCGAGTGT- GGTCATGCACTTGCGGTC -3'，经退火形成双链DNA。退火反应体系：DNA Oligo(sense) (1g/l) 5l，DNA Oligo(antisense)(1 g/l) 5 l，5×Universal Buffer 20 l，ddH2O 70 l。混匀，904 min，70 10 min，缓慢冷却至
9、室温。12%非变性PAGE凝胶检测双链DNA Oligo形成效率。 1.2.2 构建表达shRNA 慢病毒载体 Hpa I 和Xho I酶切pGCL-GFP载体以使其线性化，经退火形成双链DNA与双酶切后的pGCL-GFP载体连接。连接反应体系：酶切回收的载体DNA（100 ng/l）1 l，退火的双链DNA（100 ng/l）1 l，10×T4噬菌体DNA连接酶缓冲液1 l，T4噬菌体DNA连接酶1 l，dd H2O 7 l，于4连接12 h，37振摇16 h转化到DH5。 1.2.3 PCR鉴定及DNA测序 挑取重组阳性克隆行PCR 及DNA测序鉴定。PCR 鉴定阳性克隆的上游引
10、物：5'-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3'，下游引物：5'-GTAATACGGTTATCCACGCG-3'。PCR体系见表1，PCR反应条件：94变性30 s，94 30 s，60 30s，72 30 s，循环30次，72延伸6 min。挑选1号阳性克隆菌液测序。 2 结 果 2.1 12%PAEG非变性PAGE凝胶检测双链DNA Oligo形成效率 PAGE电泳见图1。 2.2 阳性克隆的PCR鉴定 琼脂糖凝胶电泳见图2，PCR条带大小：连接入vshRNA片段的阳性克隆PCR片段大小为：384bp；没有连接入vshRNA片段的空载体克隆P
11、CR片段大小为：322bp。 2.3 DNA测序鉴定 DNA测序鉴定的结果与实验要求的DNA序列基本一致（图3）。 3 讨 论 RNAi 技术成为一种新的反向遗传学手段，被广泛地应用于基因功能分析、信号转导通路研究和基因治疗。质粒介导RNAi 有一定的局限性，转染率低，基因抑制表达作用弱，持续时间短3，不适合体内实验。慢病毒载体是一种复制缺陷型逆转录病毒载体，以HIV-1为基础发展而得，具有许多优点，能够转染非分裂期细胞和分裂期细胞，而且病毒的遗传物质能够整合到宿主的基因组，转移基因片段容量较大，慢病毒载体RNAi 作用持久，不易诱发宿主免疫反应，因此慢病毒载体是当前基因治疗载体研究的热点4，
12、用慢病毒载体介导RNAi 的几项体内外研究5，6即显示了该技术策略在内源性基因功能研究和基因治疗前沿领域的重大意义。 HSC向MFB分化、维生素A脂滴的消失与HSC激活有何关联，是激活时重要的分子机制之一，还是仅仅为一种伴随现象。这些都是需要进一步探讨的问题，这些问题的阐明对于临床上治疗肝纤维化具有重要意义。Lepreux等7在人肝纤维化的研究提示CRBP-1基因是肝星状细胞活化信号通路中重要组成部分，何天霖等8的研究表明CRBP-1基因在大鼠肝纤维化早期和持续活化组中均明显上调。基于目前国内外有关HSC早期激活阶段视黄醇代谢途径的研究较少，我们在筛选出CRBP-1基因RNAi的有效靶序列后，
13、构建表达shRNA 慢病毒载体，以进一步研究沉默CRBP-1 基因对HSC生物学行为的影响并探讨其机制。为构建CRBP-1shRNA 慢病毒载体，购买了病毒包装系统pGCL-GFP，pHelper 1.0 (gag/pol 元件)，Helper 2.0 (VSVG元件)载体三质粒，其中pGCL-GFP载体含有能持续表达小RNA的元件，同时能表达荧光蛋白marker(GFP/RFP)，可用于病毒包装时转染效率，以及感染宿主细胞的感染效率的检测。pHelper 1.0质粒中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白; pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表
14、达的调节因子。pHelper 2.0质粒中含有单纯疱疹病毒来源的VSVg基因，提供病毒包装所需要的衣壳蛋白。本实验经PCR筛选阳性克隆测序鉴定表明，成功构建了含有GFP报告基因的大鼠CRBP-1基因shRNA慢病毒载体，为进一步研究CRBP-1基因在肝纤维化的作用机制和动物基因治疗奠定了基础。【参考文献】 1 Friedman SL. Molecular regulation of hepatic fibrosis， an integrated cellular response to tissue injuryJ. J Biol Chem，2000， 275（4）:2247-2250. 2
15、Uchio K.Cellular retinol-binding protein-1 expression and modulation during in vivo and in vitro myofibroblastic differentiation of rat hepatic stellate cells and portal fibroblastsJ. Lab Invest，2002，82(5):619-628.3 Jazag A， Ijichi H， Kanai F， et al. Smad4 silencing in pancreatic cancer cell lines u
16、sing stable RNA interference and gene expression profiles induced by transforming growth factor-J. Oncogene， 2005， 24(4): 662 - 671.4 Morris KV， Rossi JJ. Lentiviral mediated delivery of siRNAs for antiviral therapyJ. Gene Ther， 2006， 13（6）:553-558.5 Singer O， Marr RA， Rockenstein E，et al. Targeting
17、 BACE1 with siRNAs ameliorates Alzheimer disease neuropathology in a transgenic modelJ. Nat Neurosci， 2005， 8(10):1343-1349.6 Hui EK， Yap EM， An DS， et al. Inhibition of influenza virus matrix（M1）protein expression and virus replication by U6 promoter-drivenand lentivirus-mediated delivery of siRNAJ
18、. J Gen Virol， 2004， 85(7):1877-1884.7 Lepreux S.Cellular retinol-binding protein-1 expression in normal and fibrotic/cirrhotic human liver:different patterns of expression in hepatic stellate cells and myofibroblast subpopulationsJ. J Hepatol，2004，40(5):774-780.8 何天霖，吴志勇，罗 蒙，等. 应用抑制性消减杂交技术筛选大鼠不同程度肝纤维化的上调基因J. 上海交通大学学报医学版，2006，26(8):828-831.9 / 9文档可自由编辑打印