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1、IgA肾病小鼠模型的建立与鉴定【摘要】 目的 建立小鼠IgA肾病模型，为临床研究IgA肾病提供实验依据。方法 昆明种小鼠30只，分为正常对照组(10只)、模型组(20只)。采用口服牛血清白蛋白(BSA)联合尾静脉注射葡萄球菌肠毒素B(SEB)的方法制作小鼠IgA肾病模型。第12周末收集新鲜尿液，显微镜下尿红细胞定性检验;摘眼球取血，检测血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN);光镜法观察肾小球系膜细胞及基质变化;电镜法检测系膜区有无电子致密物沉积;免疫荧光法观察系膜区IgA沉积情况。结果 第12周末，模型组小鼠均出现不同程度的血尿;Scr、BUN较正常对照组显著增高(P<0.01);光
2、镜下系膜细胞及基质明显增生;电镜下系膜区电子致密物沉积;免疫荧光示系膜区大量的IgA沉积，而正常对照组则无上述表现。结论 IgA肾病小鼠模型效果良好，病理、电镜及临床指标与人类IgA肾病临床病理相似。 【关键词】 IgA肾病;模型;血尿;免疫荧光;小鼠Abstract: Objective To establish mouse model of IgA nephropathy in order to provide experiment basis for the clinical research of IgA nephropathy. Methods 30 Kunming mice wer
3、e randomly assigned into the control group (n=10) and the model group (n=20). Mouse model of IgA nephropathy was established by the method of oral intake of bovine serum albumin (BSA) together with injection of staphylococcus enterotoxin B (SEB) via the caudal vein. At the end of the 12 weeks, fresh
4、 urine was gathered for the quantitative test of hematuria; blood was taken through orbital sinus after eyeball extirpation to determine the serum creatinine (Scr) and blood urea nitrogen (BUN); the changes of mesangial cells and matrix in the kidneys were observed by light microscopy; electron micr
5、oscopy was employed to detect electron-dense deposits in the mesangial area; the expression of IgA deposition was measured by immunofluorescence staining in the mesangial area. Results By the end of 12 weeks, there were different degrees of hematuria in model group mice. BUN and Scr levels in model
6、group were significantly higher than in the normal control group (P<0.01). Light microscopy showed evident proliferation of mesangial cells and matrix. Electron microscopy demonstrated a high electron dense deposition in the mesangial area, while the above abnormalities were not observed in t
7、he normal control group.Conclusion The mouse model of IgA nephropathy proves effective, with pathological electron microscopic and clinical parameters similar to the clinical pathology of human IgA nephropathy.Key words: IgA nephropathy; model; hematuria; immunofluoresence staining; miceIgA肾病世界范围内广发
8、的一种系膜增生型肾小球肾炎，占原发性肾小球疾病的10%20%，中国、日本、新加坡等发病率较高，其中有20%30%的患者进展到肾衰1。建立与人类临床病理生理相似的IgA肾病动物模型，对研究IgA肾病的发病机理、临床治疗等具有重要的作用。本实验采用口服牛血清白蛋白联合尾静脉注射葡萄球菌肠毒素的方法制作IgA肾病小鼠模型，为进一步探索IgA肾病提供实验依据。1 材料和方法1.1 实验材料1.1.1 实验动物 昆明种小鼠30只，鼠龄(10-12)周，体重2026 g，雄性，动物编号SCXK(苏)2005-0005，由徐州医学院实验动物中心提供。1.1.2 主要实验试剂和设备 牛血清白蛋白(BSA,上海
9、明睿生物有限公司，产品批号RF101-010);葡萄球菌肠毒素B(SEB,北京博迈世纪生物技术有限公司);兔抗小鼠IgA抗体(北京博奥森生物技术有限公司，抗体货号bs-0774R); 异硫氰酸荧光素(FITC)-标记的羊抗兔IgG(Millipore corporation); MicromHM340石蜡切片机;光学显微镜(日本Carton);日本Sysmex CA-1500自动生化分析仪;电镜(H-600)，切片机(LKBV型)。1.2 实验方法1.2.1 酸化水的制备 新鲜的双蒸水中加入盐酸，浓度为8.5 mmol/L。即1 000 ml双蒸水中加入10%盐酸3.2 ml。1%BSA酸化水
10、的制备,1 g BSA加入100 ml酸化水。1.2.2 造模方法 适应性喂养1周后，取新鲜尿液进行显微镜下尿红细胞检测，均为阴性，将30只小鼠随机分为正常对照组(10只)、模型组(20只)。正常对照组小鼠自由饮水与饮食;模型组小鼠除自由饮水和饮食外，前5周隔日予BSA(200 mg/kg)灌胃;第6周起予BSA(20 mg/kg，500 mg BSA溶于500 ml无菌生理盐水中)尾静脉注射，每天1次，连续3天;第8周起予SEB(0.5 mg/kg, 1 mg SEB溶于25 ml无菌生理盐水中)尾静脉注射，每周1次，连续3周，观察至第12周末。1.2.3 IgA肾病小鼠模型的鉴定1.2.3
11、.1 血、尿液检测 第12周末留取小鼠新鲜尿液，行尿红细胞定性检测;经摘眼球取血(待测Scr，BUN)后，处死小鼠，留取右侧肾脏分别固定于10%甲醛及戊二醛中，行病理(光镜和电镜)及免疫荧光检查。1.2.3.2 光镜检查 小鼠肾组织经10%甲醛固定，石蜡包埋，5 m切片,苏木精-伊红染色(H-E)，光镜下观察系膜区系膜细胞及基质有无增生。1.2.3.3 电镜检查 取材,前固定,漂洗,后固定,漂洗,脱水，置换及浸透，包埋及聚合，修块及切片，染色，电镜观察。1.2.3.4 免疫荧光 小鼠肾组织经10%甲醛固定，石蜡包埋，5 m切片依次经二甲苯 20 min,二甲苯 20 min,95%乙醇5 mi
12、n,95%乙醇 5 min,双蒸水5 min×3次,3%H2O2 10 min,PBS 5 min×3次,抗原修复(微波炉中高火5 min,低火15 min),自然冷却,PBS 5 min×3次,5%羊血清1 h,兔抗小鼠IgA(1100),4过夜,PBS 5 min×3,FITC标记羊抗兔IgG(1100) 4过夜,PBS 5 min×3,甘油封片,荧光显微镜下观察摄像。免疫荧光半定量标准:半定量标准参照目前国内通用的5级法(±+)分级:±：低倍镜下不能显示;+：低倍镜下似乎可见，高倍镜下可见;+:低倍镜下可见，高倍镜下清
13、晰可见;+：低倍镜下清晰可见，高倍镜下耀眼;+: 高倍镜下刺眼。1.3 统计学处理 全部数据采用SPSS 13.0医学统计软件进行处理，计数资料用±s差表示，采用两独立样本t检验;等级资料用两独立样本非参数检验。P<0.01为差异有统计学意义。2 结 果2.1 一般情况 造模过程中，正常对照组小鼠无死亡，模型组小鼠先后死亡3只，分析原因可能是灌胃器误插入气管，或插入过深导致小鼠食管及胃黏膜损伤。尾静脉注射SEB后，小鼠出现倦怠、少吃少动等现象，2 h后恢复正常。2.2 血、尿指标检测 12周末，采集新鲜尿液光镜下尿红细胞计数。结果显示模型组小鼠明显高于正常对照组(P&a
14、mp;lt;0.01)(表1);摘眼球取血，留取血清，检测血Scr和BUN。结果显示模型组较正常对照组明显升高(P<0.01)(表2)。表1 2组小鼠尿红细胞计数的比较表2 2组血BUN和Scr的比与正常对照组比较：*P<0.012.3 镜下结构改变2.3.1 光镜 模型组小鼠肾组织主要表现为肾小球毛细血管襻扩张，系膜细胞及基质明显增生，毛细血管腔部分闭锁，部分小管扩张;光镜下正常对照组小鼠肾小球，肾小管，及间质组织形态结构未见异常，系膜细胞及细胞基质未见增多(图1)。图1 12周末，各组小鼠光镜下肾组织病理变化的比较(H-E染色，×400)A.模型组,肾
15、小球系膜细胞及基质增生,毛细血管腔部分闭锁，部分小管扩张;B.正常对照组,肾小球系膜细胞及基质未见增生,毛细血管开放良好2.3.2 电镜 模型组小鼠肾小球系膜区有大量电子致密物沉积，而正常组小鼠肾小球系膜区无或有少量的电子致密物沉积(图2)。图2 12周末，各组小鼠电镜下肾组织病理变化的比较(×10 000)A.模型组,系膜区大量的电子致密物沉积;B.正常对照组,系膜区无电子致密物沉积2.4 免疫荧光检测 12周末，免疫荧光可以看到，系膜区IgA荧光强度大多为+，而正常组系膜区IgA荧光强度为±+，差异有统计学意义(表3、图3)。表3 2组小鼠肾脏系膜区IgA荧光半定量比较
16、3 讨 论自Rifai等于1979年首次用BALB/c小鼠成功制作IgA肾病模型以来，许多学者基于IgA肾病已知的发病机制成功复制了许多IgA肾病模型2-6。主要包括:免疫诱导型、继发病变型、自发病变型。但由于存在种种问题，与人的IgA肾病病理变化差距很大，模型建立的滞后导致对IgA肾病的研究较少，对IgA肾病的治疗未获得新的手段。国内常用的IgA肾病为异种蛋白所诱导的免疫诱导型，即口服牛血清白蛋白(BSA)联合尾静脉注射葡萄球菌肠毒素(SEB)。由于部分患者对某些上呼吸道病原体、肠道菌群、食物抗原有较高的血清抗体滴度， 认为黏膜免疫在发病中起到一定作用7。故口服免疫原如BSA及静脉注射葡萄球
17、菌、大肠杆菌、呼吸道病毒等病原微生物成分或免疫复合物常用于诱导主动性IgA 肾病模型。BSA口服免疫可使机体IgA抗体的产生，SEB的具体机制目前还不十分明确，大多数认为SEB还可破环肝脏网状内皮系统，引起IgA清除不完全，进而引起免疫复合物在系膜区的沉积。17只模型小鼠荧光证实全部有IgA沉积;光镜下肾小球系膜细胞和系膜基质增生;电镜下肾小球系膜区可见大量的高电子密度的致密物沉积;临床的尿、血检测随着肾脏病理变化的加重而逐渐加重，且与正常组比较差异有统计学意义，说明造模成功。此方法操作简单，重复性好，成功率高，应该是目前理想的、有研究价值的动物模型，能为进一步研究IgA肾病的发病机制及治疗提
18、供基础平台。【参考文献】 1 Donadio JV，Grande JP.IgA nephropathy J.N Engl J Med，2002，347(10)：738-748.2 Bagheri N, Pepple DA，Hassan MO, et al. Development of immune complex glomerular injury J.Lab Invest, 2005,85(3):354-363.3 Jia Q,Pestka JJ. Role of cyclooxygenase-2 in deoxynivalenol-induced immunoglobulin a nep
19、hropathy J.Food Chem Toxicol,2005, 43(5):721-728.4 Koyama A, Sharmin S, Sakurai H, et al. Staphylococcus aureus cell envelope antigen is a new candidate for the induction of IgA nephropathy J.Kidney Int,2004,66(1):121-132.5 Suzuki S, Gejyo F, Nakatomi Y, et al. Role of IgA,IgG, and IgM antibodies ag
20、ainst Haemophilus parainfluenzae antigens in IgA nephropathy J. Clin Nephrol,1996,46(5)：287-295.6 Sharmin S,Shimizu Y,Hagiwara M, et al. Staphylococcus aureus antigens induce IgA-type glomerulonephritis in Balb/c mice J. Nephrol,2004,17(4):504-511.7 Kuki K, Gotoh H, Hayashi M, et al. Immunity of tonsil and IgA nephropathy-relationship between IgA nephropathy and tonsillitisJ. Acta Otolaryngol Suppl, 2004, (555): 6-9.10 / 10文档可自由编辑打印