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1、钙拮抗剂对大鼠心肌缺血再灌注初期生长反映基因7表达的阻碍李海青，石方才，高分飞，贾强用【摘要】目的：研究钙拮抗剂(维拉帕米、地尔硫芭卓和硝苯地 平)对大鼠心肌缺血再灌注(I/R)芭卓初期生长反映基因-1 (Egr-1)表 达的阻碍。方式：大鼠随机分为假手术组、I/R组、二甲基亚碉组、 维拉帕米组、地尔硫芭卓组、硝苯地平组。Western blot法测定Egr-1 蛋白表达水平的转变；RT-PCR法测定Egr-1 mRXA表达水平的转变。 结果：与假手术组比，I/R组Egr-1蛋白及Egr-1 mRNA表达显著增高 (P<；与I/R组比，维拉帕米组、地尔硫芭卓组和硝苯地平组Egr-
2、1 蛋白及Egr-1 mRXA表达明显减少(P<。结论：维拉帕米、地尔硫芭 卓和硝苯地平都可抑制缺血再灌注心肌Egr-1蛋白及Egr-1 mRNA的过 度表达。【关键词】钙拮抗剂；缺血再灌注；初期生长反映基因TAbstract Objective: To study the effects of calcium antagonist(verapamil、diltiazem and nifedipine)on early growth response gene-l(Egr-l)expression in rats after myocardial ischemia-reperfu
3、sion(I/R). Methods: Rats were randomly- assigned into Sham> I/R、DMSO> verapamil、diltiazem、nifedipine groups. The expression levels of Egr-1 protein and mRNA were examined by Western blot and RT-PCR, respectively. Results: Compared with sham group, Egr-1 protein and mRNA of I/R group overexpres
4、sed(P<. The expression levels of Egr-1 of verapamil、diltiazem nifedipine groups significantly decreased, compared with I/R group (P<. Conclusion: Verapamil > diltiazem and nifedipine can inhibit the overexpression of Egr-1 protein and mRXA in rats caused by I/R.Key Words calcium ata
5、gonist; ischemia-reperfusion; early growth response gene-1细胞内钙超载是缺血再灌注(I/R)损伤的要紧病理机制之一，而 作为组成I/R损伤分子通路一起分子基础的核内转录因子一一Egr-1 1，其与细胞内Ca2+之间存在超级紧密的联系，Ca2+可通过不同的 信号转导途径直接或间接阻碍Egr-1的表达。众所周知，钙拮抗剂防 治心肌I/R损伤的要紧机制是阻断心肌细胞膜钙通道，降低细胞内钙 离子浓度(Ca2+)i,拮抗钙超载。而咱们的前期工作也证明了 F2 和维拉帕米均能通过阻断心肌细胞膜钙通道，降低心肌细胞(Ca2+) i, 避免钙超载拮抗心
6、肌I/R Egr-1的异样表达2,3。因此咱们提出假 设：具有钙拮抗作用的化合物均有抑制Egr-1高表达的效应。为了验 证这一假设，进一步探讨钙拮抗剂的共性作用，本实验通过成立大鼠 心肌I/R损伤模型，运用3种经典的钙拮抗剂，观看其对Egr-lmRXA 及Egr-l蛋白表达的阻碍，为进一步探讨其分子生物学机制提供有力 的依据。1材料与方式动物SD大鼠广州第一军医大学动物中心提供许可证号： SCXK（粤）2006-0015, 2006B008； SPF雌雄不拘，体质量 250350g。仪器与试剂BL-420E信号记录分析系统（四川成都泰盟科技，中国）；低温高 速离心机（Eppendorf公司,德
7、国）；乳化分析仪（IKA公司，德国）;聚 丙烯酰胺凝胶电泳相关仪器、凝胶成像分析系统、转印系统、紫外分 光光度计、全自动PCR扩增仪（Bio-RAD公司，美国）；压力蒸汽灭菌 器（嘉兴市中新医疗仪器，中国）；电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗 器械厂，中国）；二甲基亚飒（DMS0,上海凌峰化学试剂，中国）；兔抗 大鼠EgrT多克隆抗体（Santa Crutz公司，美国）；HRP标记的山羊抗 兔IgG、小鼠抗大鼠B-actin单克隆抗体、HRP标记2抗IgG （博士德 公司，中国）；硝酸纤维素膜、Trizol试剂、PCR扩增反映试剂盒（Invitrogen公司，美国）；Egr-l引物和8 -act
8、in引物（上海华丽生物 工程公司，中国）；第一链cDNA合成试剂盒（MBI Ferment as公司，立 陶宛）;维拉帕米（恒瑞医药股分,中国）;硝苯地平和地尔硫芭卓（Sigma 公司，美国）。心肌I/R模型的成立及分组大鼠称重,乌拉坦kg）腹腔麻醉，分离气管后当即行正压人工呼 吸（频率60次/min,流量2mL/100g）。从左侧第3、4肋间打开胸腔, 暴露心脏，剪破心包膜，用2个小拉钩撑开并向下按压胸廓使心脏暴 露于胸腔外，在肺动脉圆锥左缘平左心耳下缘2mm冠状动脉处进针， 用5/0丝线穿过心肌层。结扎冠状动脉时连同直径2mm的塑料胶管一 路结扎造故意肌缺血60min,然后解除结扎再灌注1
9、80mino大鼠随机分为I/R组（术前5min予NS ImL/kg,结扎大鼠冠状动 脉前降支,60min后松开结扎线，恢复血流,再灌注180min） ； DMSO 组（术前5min改NS为DMS0,手术操作同I/R组）；维拉帕米组（术前 5min予维拉帕米kg,用NS稀释，一样依照ImL/kg给予）；地尔硫芭卓 组（术前5min予地尔硫芭卓kg,用NS稀释成ImL/kg给予）；硝苯地平 组（术前5min予硝苯地平kg,用NS稀释成ImL/kg给予）；假手术组（术 前5min予NSlmL/kg,手术时冠状动脉前降支穿线但不结扎，持续观 看 240min）。Egr-1蛋白测定取lOOmg心肌组织块
10、，用干净的剪子将组织于冰上快速剪碎，加 入预冷的裂解液20mmol/L Tris HC1, 150mmol/L NaCl,体积分数 1 %的 TritonX-100, Immol/L 乙二胺四乙酸；pH 与 5 U L 的 Protease inhibitor cocktail III,用乳化分散仪将心肌组织于冰上充分匀浆, 每一标本匀浆30s冰上静置30s,共匀浆3次，匀浆至无明显组织颗 粒为止，冰上静置lOmin, 2655g,离心10min(4),弃上清液，加入 裂解液200 UL,冰上静置裂解2h,期间不断涡旋使其充割裂解，然 后15294g,离心20min(4),吸取部份上清液用考马
11、斯亮蓝法测定蛋 白质浓度，部份上清液与5X上样缓冲液4 ： 1混合，煮沸5min。配制 分离胶与浓缩胶，然后每一泳道加60 Hg蛋白样品，电泳(125V, 80min),转膜(350mA, 60min) o 封锁液封锁 lh,加入 1 ： 200 Egr-l 抗体稀释液，4c留宿，洗膜3次，每次10min,加1 ： 1500的2抗稀 释液室温孵育2h,洗膜3次,每次10min,滴1 ： 1 Eel化学发光试剂 于膜上，反映lmin,压片Imin,曝光lmin,将胶片进行显影、定影。Egr-1 mRNA的测定取-30冰箱保留的100mg心肌组织块，转移到5mL离心管中，每管加入ImLTrizol
12、试剂，用干净的剪子将组织于冰上快速剪碎，用乳化分散仪将心肌组织于冰上充分匀浆，每一标本匀浆30s冰上静置 30s,共匀浆3次，匀浆至无明显组织颗粒为止。然后转移至2mL离心 管中，室温静置5nlin,每管加氯仿，振摇15s,室温静置3nlin, 10621g, 离心10min(4),吸取上层水相，移至另一新的离心管中，加预冷的 等体积异丙醇，-30冰箱中静置30min, 15294g,离心lOmin(4), 弃上清液，加体积分数75%的乙醇1mL,摇振，充分洗涤沉淀，7600g, 离心5min(4),弃上清液，超净台中干燥2min,沉淀重悬于 RNase-free水中，紫外分光光度计测定RNA
13、浓度及A260/A280比值。 提取的总RXA冻存于-70冰箱。采纳第一链cDXA合成试剂盒逆转录 合成cDNA。采纳PCR扩增反映试剂盒合成DNA。EgrT引物(512bp)： 上游 5 ' -GCAACACTTTGTGGCCTGAA-3 ',下游 5 ' -GAGTTGGGACTGGTAGGTGT-3 r ； 3 -actin 引物(380bp)：上游 5' -GTGGGTATGGGTCAGAAGGA-3z，下游 5' -AGCGCGTMCCCTCATAGAT-3z。 PCR产物经质量分数1%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像分析系统进行拍 照和图像分析。统
14、计学处置所有计量资料以x±s表示，采纳单因素方差分析进行组间比较。2结果钙拮抗剂对I/R心肌Egs-1蛋白水平的阻碍各组均以Egr-1灰度与P -actin灰度比值进行比较。以I/R组 的灰度值为100%,那么假手术组、DMSO组、维拉帕米组、地尔硫芭 卓组、硝苯地平组灰度值别离为±%，土, ±%，土和土%。其中，与假 手术组比，I/R组和DMS0组Egr-1蛋白表达显著增高(P< ； DMS0 组与I/R组比无统计学意义；与I/R组比，维拉帕米组、地尔硫芭卓 组及硝苯地平组Egr-1蛋白表达明显减少(P<,图Do钙拮抗剂对I/R心肌E
15、gr-1 mRNA水平的阻碍以Egr-1和8 -actin光密度值的百分比来反映各组Egr-l mRNA 的转录水平。以I/R组的灰度值为100%,那么假手术组、DMSO组、 维拉帕米组、地尔硫芭卓组、硝苯地平组灰度值别离为±%, ±%, ±%, ±%和±%。其中，与假手术组比，1/R组和DMSO组Egr-1蛋白表达显 著增高(P<； DMSO组与I/R组比无统计学意义(P>；与I/R组比, 维拉帕米组、地尔硫芭卓组及硝苯地平组Egr-1蛋白表达明显减少 (P<,图 2) °3讨论研究说明，心
16、肌I/R损伤的发生与细胞内、外Ca2+散布的破 坏即钙超载紧密相关。钙拮抗剂通过阻断心肌细胞膜钙通道，降低细 胞(Ca2+)i拮抗钙超载医治心肌I/R损伤己成为目前的一种共识4,5。Egr-1属于即刻初期基因家族，多种刺激因素(缺血、缺氧等) 都可诱导其快速表达。Egr-l初期被以为与细胞的生长分化及肿瘤发 生紧密相关。除此之外，Egr-1还参与了多种病理生理进程，是多种 细胞外环境的刺激信号与靶基因表达之间的耦联分子6,7。Yan等 1采纳反义寡核苜酸(AS-ODN)技术证明，在未经Egr-1 AS-ODN处 置的肺组织，I/R进程中，EgrT表达上调，而异样表达的Egr-1又起 着“分子开
17、关”的作用，通过诱导一系列下游基因的表达，最终引发 炎症反映、凝血和血管通透性这三大I/R病理损害。本实验的结果也 证明，I/R组的Egr-1蛋白和Egr-1 mRNA的表达水平较假手术组明 显升高，提示Egr-1在I/R病理进程中发挥着超级重要的作用。Ca2+是细胞信号转导进程中最多见的第二信使，细胞(Ca2+)i升 高可通过量条途径磷酸化Ca2+灵敏的基因转录序列，进而调剂靶基因 的表达。研究说明，Ca2+可通过磷酸激酶C诱导牛冠状动脉内皮细胞 及心肌细胞Egr-1的表达8,另外 及2+也可通过MAPK、Ca2+/CaM 依托性蛋白激酶等途径调剂Egr-1表达9, 10。以上事实说明Ca2
18、+ 与Egr-1表达存在必然的联系：Ca2+可通过不同机制直接或间接阻碍 Egr-1转录表达，进而一起调剂细胞的生长、增殖和分化。本课题组 前期研究证明能够阻断心肌细胞膜钙通道的F2及作为阳性对照药的 维拉帕米能够抑制心肌I/R所致的Egr-1蛋白和Egr-1 mRXA的异样 表达2o本实验结果亦显示，维拉帕米、地尔硫芭卓和硝苯地平均 能抑制I/R所致的心肌组织Egr-1蛋白和Egr-1 mRNA的异样表达， 由此咱们有理由以为，降低细胞(Ca2+)i,进而抑制EgrT的表达，是 钙拮抗剂拮抗心肌I/R损伤作用的重要机制之一。从本实验能够看出，3种钙拮抗剂对I/R所致的Egr-1异样表达 的抑
19、制作用强弱并非完全相同，Egr-1蛋白和Egr-1 mRXA的结果都显 示维拉帕米和地尔硫芭卓的作用较强，而硝苯地平的作用较弱，与本 课题组前期离体细胞的实验结果相同。这可能与3种药物的选择性作 用位点不同有关，维拉帕米和地尔硫芭卓要紧作用于心脏，而硝苯地 平要紧作用于血管。但最终还需通过量效关系才能确信3种药物的作 用强弱。本实验以I/R心肌作为模型，初步探讨钙拮抗剂对心肌I/R Egr-1蛋白和Egr-1 mRXA的阻碍，揭露了钙拮抗剂防治心肌I/R损伤 的新机制，对尔后进一步探讨其具体分子机制奠定了基础。【参考文献】1 Yan SF, Fujita T, Lu J, et al. Egr
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