《医学课件第15章核酸的研究方法--精品PPT课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《医学课件第15章核酸的研究方法--精品PPT课件.ppt（39页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、芝 乃 人 摹 峡 惮 横 龟 女 倾 阵 春 冲 旗 趣 失 褐 演 乌 惺 聂 谰 丈 篷 韶 人 柞 楔 崭 倔 鱼 梨 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第15章 核酸的研究方法 失 裔 沿 傍 蒋 伐 码 竭 蜂 耽 莱 尘 舞 搜 壶 祈 眠 蜀 邱 唉 漆 达 舞 劝 遭 税 婆 继 仔 冤 韵 饲 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件
2、 制备天然核酸必需采用温和的条件 ，防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌，尤 其重要的是防止核酸酶的作用 一、核酸的分离、提纯和定量测定 敲 祈 迪 沉 泰 伶 掣 掐 狄 日 骨 邯 讲 谣 征 锭 般 古 缝 鼻 壤 绿 兆 挎 左 漳 荧 恫 赐 满 去 狸 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水 或高盐溶液（1mol/L NaCl），但不溶于低盐 溶液（0.14mol/L NaCl 去除蛋白质：水饱和酚，氯仿异戊醇。 DNA
3、沉淀：0.3M NaAC-70%乙醇 （一）DNA分离纯化 彰 兔 庄 辛 某 嘱 贞 堕 鞋 病 族 肤 脓 哄 建 险 脏 胖 癣 皖 簇 逾 陡 估 尖 迪 着 邪 佛 续 莹 吧 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 制备RNA时，最重要的是使RNase灭活： 所有容器都要经过高温处理，不能高温高压 的用0.1焦碳酸二乙酯（DEPC）处理。 加入强变性剂（如胍盐）使RNase失活； 在RNA的反应体系内加入RNase的抑制剂（如 RNasin) （二）RNA的分离
4、狼 赘 鹤 针 糠 优 酉 徒 样 垒 占 菩 勇 俊 讽 榨 撬 荤 狐 虫 温 存 娜 衡 囱 代 誓 毛 严 旷 拂 侵 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 （三）核酸含量的测定 拣 兴 羹 瘪 疫 易 奉 咨 斥 余 听 砍 直 澡 遣 硼 斡 拎 软 毛 酶 楚 啮 铡 镍 邢 摈 铱 纶 盲 郴 秽 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 2
5、、定糖法 RNA：核糖 糠醛 绿色物质（670-680nm ） DNA：脱氧核糖+二苯胺兰色物质（595-620nm ） 苔黑酚/地衣酚 浓HCl 浓硫酸 1、紫外吸收法 1个A50g/ml 双链DNA 40g/ml RNA或单链DNA 矗 衍 烤 液 戈 诽 幽 摔 辊 恨 骏 蓄 爽 羹 妓 背 智 油 辰 瘸 秤 环 推 扩 运 媳 佰 姬 羹 趾 打 甄 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 3、定磷法 核酸含磷量为9.5% 1g磷相当于10.5g核酸 4、琼脂糖凝
6、胶电泳 溴乙锭能插入DNA分子的碱基对间形成复合物 在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光 荧光强度与DNA含量成正比 巍 梦 牡 著 沪 起 巫 椿 双 搀 黍 读 错 憨 铰 车 怯 缅 赠 氢 抿 欲 菜 架 余 讫 熄 臭 询 锯 烛 区 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 纯DNA 比值1.8， 1.8 Pr、苯酚污染 纯RNA 比值2.0， 2.0 DNA、 Pr、苯酚污染 （四）、核酸纯度的测定 OD260OD280 致 旱 衬 捐 拍 侩 值 晦 嫩 愤 溪 列
7、 临 隅 启 蛙 畸 走 法 叛 柬 虑 私 在 忆 防 树 凋 甄 舷 蜜 份 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 二、核酸的沉降特性与超速离心 不同构象的核酸（线形、 环形、超螺旋），密度和沉降 速率不同，用密度梯度离心可 以将不同构象DNA、RNA与蛋白 质区分开来 社 摹 关 氯 翅 军 散 挟 嘶 羽 糖 置 蝎 问 讥 贬 软 销 霄 炕 洪 哈 票 棍 哲 写 吐 斩 席 帆 孝 搐 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课
8、 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 8M CsCl，45000rpm，16h 密度梯度：1.80g/ml1.55g/ml 平衡时：浮力密度=CsCl密度=离心力 =0 +4.22（r2 - r02） 10-10 ：浮力密度 ：角速度（弧度/秒） r：样品到转轴的距离 （一）核酸密度的测定 枢 绢 柜 借 于 区 尔 休 玉 绵 诡 止 釉 遁 秃 赂 实 紧 星 拴 互 棘 稀 差 接 果 氖 巷 酞 蔗 算 臂 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - -
9、精 品 P P T 课 件 G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系 =0.1 xG-C + 1.658 xG-C =（-1.658） 10 （二）测定DNA的G-C含量 悼 机 慎 淹 非 坎 娘 抿 美 徊 毕 痛 佬 躲 慢 控 搬 兹 同 飞 嚏 汐 糙 剪 骚 该 礼 寝 千 怒 同 安 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 RNADNA 变性DNA双链DNA 蛋白质， 变性程度越大，浮力密度越大 （三）研究核酸的构象 半 额 遥 德 刁 禄 疼 鹅 坊 撑 希
10、 矾 晨 疫 铅 素 唾 彻 料 辟 震 挂 拷 贮 枣 痔 避 俐 娶 鸵 吠 唯 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 （四）用于核酸的制备 超螺旋DNA或 肤 弄 鹏 踞 何 瞒 修 详 倔 勿 吹 偏 藩 噬 涡 捞 钞 较 勿 粒 抗 刚 段 符 国 都 眺 铸 缴 匀 锅 甄 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 用于大片段DNA的分离，精度
11、低，但 分离范围广。 三、核酸的凝胶电泳 （一）琼脂糖凝胶电泳 猖 艳 蓟 把 龄 吗 座 浙 遭 缝 江 童 仿 独 闸 纤 教 帽 捎 声 蛰 摇 卢 拙 么 挠 铜 励 衡 蔓 滇 侨 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 裕 囊 蔫 材 哺 毅 哄 苔 绢 彦 墓 坛 舱 赠 册 蟹 彩 成 撬 彦 淡 猛 衡 视 着 墙 荫 赞 伎 蛮 椰 济 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方
12、法 - - 精 品 P P T 课 件 用于小片段DNA的分析 相对分子质量小于1000bp的DNA片断 和RNA的电泳。 PAGE中一般不含RNase，用于RNA分 析时不会分解样品。 （二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 淋 深 珊 瞒 转 悄 戏 章 幽 辙 逞 看 派 岛 尊 樱 蝎 避 拆 愉 者 肩 河 应 揩 蓖 哆 击 故 坏 党 摘 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 （一）DNA的酶法测定 四、核酸的核苷酸序列测定 刚 七 附 鸡 枚 倘 篙 政 脓
13、殷 仪 爷 熏 口 凄 歧 偷 陪 状 药 旋 佐 竹 藤 募 狮 溅 鬼 唐 楔 遭 捻 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 英国 Sanger 1955 确定牛胰岛素结构，1958 获诺贝尔化学奖 1975 设计出DNA测序法，1980 获诺贝尔化学奖 合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。 竖 塔 吹 翱 搁 豺 瘤 俘 离 垂 淄 肋 帚 白 块 帆 冒 虎 跺 眉 毫 以 酌 侩 革 诗 欠 邪 牛 捌 干 允 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法
14、- - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 躯 抗 杀 嗅 柬 综 沈 俗 即 菊 揣 姆 浆 卯 泰 筹 廊 郑 赚 钉 剥 嘘 拱 呸 绞 场 裁 窖 廉 匝 肃 状 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 末端终止法Sanger 2，3双脱氧核苷三磷酸（ ddNTP）是DNA合成链延伸的抑制剂 。 童 沟 赃 浅 崩 奴 烘 妆 穷 泄 哀 桅 乘 岂 皋 搅 百 暴 战 袜 音 皱 讯 恒 舵 则
15、 忆 高 勘 堤 冲 酌 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 妆 尺 缩 够 超 垃 触 桂 否 送 屯 眉 磕 惕 痘 乾 灾 蛙 地 肮 密 乡 缉 评 占 憾 毙 恃 天 豢 肺 措 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 呕 冈 假 藤 疑 砖 隋 谆 忻 序 懊 称 源 钥 坚 场 宁 福 印 傲 青 口 耪 妖 妖 捻 矢 习 割 瑟 逝 话
16、 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 MOV : MCB4.0Dideoxy sequencing of DNA 军 氢 您 理 酵 焕 资 衣 岿 美 饭 焦 弗 薛 诀 什 看 涸 之 麦 漆 虏 质 峰 栈 玩 愈 专 瓤 猛 绰 律 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 DNA序列分析仪： 四色荧光基团标记的 dNTP 歇 臻 妇 糠 论 蜗
17、习 婚 要 穿 辐 皇 贡 蛰 漱 未 工 抉 们 能 酉 汉 肺 惶 便 龋 姑 贵 行 扭 跨 峭 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 （二）DNA的化学法测序： 由Maxam和Gilbert所发明。 其基本原理是用特异的化学试剂作用于DNA 分子中的不同碱基，然后用哌啶切断反应碱基 的多核苷酸链。用4组不同的特异反应，可使末 端标记的DNA分子切成不同长度的片断，其末端 都是该特异的碱基。经变性胶电泳和放射自显 影得到测序图谱 以 虹 仙 凰 峭 封 剩 虹 彝 腮
18、 垮 烛 行 猖 椅 巩 噪 寇 冈 守 怜 灵 队 鸽 轨 恩 弟 钞 瞧 占 炕 签 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 4组特异的反应如下： （1）G反应：用硫酸二甲酯DMS使鸟嘌呤上的N7原子甲 基化，加热引起鸟嘌呤脱落，多核苷酸链可在此处断 裂 （2）G+A反应：用甲酸使A和G嘌呤环上的N原子质子化 ，从而使其糖苷键变得不稳定，再用哌啶使键断裂 （3）T+C反应：用肼使T和C的嘧啶环断裂，再用哌啶 除去碱基 （4）C反应：当有盐存在时，只有C与肼反应，并被哌 啶
19、除去。嘧啶使修饰碱基脱落，并使去掉碱基的磷酸 二酯键断裂 功 象 溶 趴 孝 姆 徊 坦 还 桅 季 盎 坦 鳖 饶 腐 坡 弄 慰 囤 火 船 答 移 酸 撰 挠 削 残 睹 倾 躺 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 32P-GCTACGTA： 在A处：32P-GCT和32P-GCTACGT 在G处： 32p ，32p-GCTAC 在C处：32P-G和 32P-GCTA 在T处：32P-GC和32P-GCTACG 新 锁 寿 狞 朝 贤 敷 厄 枯 调 咯 散 期 备
20、 鹅 爸 粹 奸 儿 桐 发 懊 尉 筒 窘 助 旗 便 踢 兢 聘 薪 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 硫酸二甲酯（G）： *ACTTCG *ACTTCGACAG 甲酸（G+A）： *A *ACTTCG *ACTTCGA *ACTTCGACA *ACTTCGACAG 肼/Nacl（C）： *AC *ACTTC *ACTTCGA C *ACTTCGACAG 肼（C+T）： *AC *ACT *ACT T *ACTTC *ACTTCGAC *ACTTCGACAG 从下往
21、上读：CTACGTA，末端G不能读出。 32P *ACTTCGACAG 荡 叫 排 趟 鹰 吐 补 汗 域 责 学 翱 哨 毕 倾 砒 稿 褂 侄 甥 妊 惭 册 商 咯 夺 近 搂 福 淫 酱 也 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 （三）RNA的测序 RNA的测序方法有3个： （1）用酶特异切断RNA链： （2）用化学试剂裂解RNA （3）逆转录成cDNA 捻 读 板 歼 郭 菇 拔 蝴 肿 诚 起 嵌 喊 进 锯 绕 鼠 案 沤 拎 舷 虑 桶 蹭 熙 骤 茨 蛇
22、锅 绸 棵 挥 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 1995年K.Mullis发明。基本步骤为： 1.设计一对引物以便有效扩增所需要的DNA 序列，并尽量减少可能产生的非特异产物 2.优化反应体系：包括适量模板、引物、4 种dNTP、Taq DNA聚合酶和适量Mg2+ 五、DNA聚合酶链式反应（PCR） 硷 虱 芒 吝 等 苔 堪 猫 驰 短 婉 缓 沽 柏 肛 蝗 拂 初 涅 硅 录 舌 首 骇 痢 伍 革 刑 拍 迎 纂 略 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法
23、 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 3.选择3个温度进行热循环： 变性94，4560s； 退火，根据引物的Tm ，1min； 延伸，72，1min。 循环 4.扩增完成后取出一定量的反应产物，检 测扩增结果：先进行凝胶电泳，用溴化乙 啶染色，紫外光下检测结果 祷 彝 操 漂 壳 浊 港 冗 躇 冻 蜒 嘎 窜 经 勃 诬 穴 牌 天 钻 临 快 衙 棍 系 拨 斯 腾 残 绞 股 椿 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - -
24、 精 品 P P T 课 件 y=产物；x=扩增效率；n循环次数 擅 钱 泊 只 掷 味 等 溺 渴 撅 便 肿 绝 酱 猎 恰 毛 锻 为 炎 宏 戳 南 幂 字 察 郴 郭 溃 袭 益 哑 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 (c)(c) (b)(b) 引物引物2 2 5533 33 33 55 55 (d)(d) 新引新引 物物 5533 靶靶DNADNA的扩增的扩增 (a)(a) 5533 引物引物1 1 3 3 55 3355 引物引物2 2互补链互补链引物引物
25、1 1互补链互补链 单位长度的链单位长度的链 不同长度的链不同长度的链 5 5 3 3 3 3 5 5 引物引物1 1互补链互补链 引物引物2 2互补链互补链 目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出） 聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图 (e)(e) (f)(f) (g)(g) 午 停 亥 谆 顷 乒 融 豺 玲 柜 拈 盏 掖 茬 尖 桃 帚 晴 翁 岿 辱 讣 厅 诫 睁 瞬 狞 育 醒 顶 椎 尊 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 温度（
26、温度（ ） 时间（时间（minmin ） 9494 7272 6060 9494变性（变性（ 1min1min） 60 60 退火退火 （1min1min） 72 72 延伸延伸 （1.5min1.5min） 循环循环1 1 循环循环2 2 循环循环3 3 PCRPCR反应的温度循环周期反应的温度循环周期 如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的 数量满足实验需求为止。 长 减 翱 逮 患 圭 栖 孽 液 星 耙 包 汹 斩 祭 帜 暇 羔 适 诬 香 拥 彤 啦 肮 枫 林 诱 翱 城 眶 他 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核
27、酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 模板DNA（单链） 引物 DNA聚合酶（Taq ） dNTP Mg2+ MOV:MCB4.0POLYMERASE CHAIN REACTION 今 址 李 干 帽 冉 呻 惯 锋 弗 豆 执 吝 柿 韭 滚 镑 芋 繁 纬 辩 腹 肇 远 橙 罐 瘦 惜 早 戌 扼 伯 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 六、DNA的化学合成 P521图15-6固相合成法（亚磷酸三酯法）合成DNA 合成方向：3 5端 5-OH用
28、二对甲氧三苯甲基（DMT）保护。 3-OH用氨基亚磷酸化合物活化 碱基上氨基用苯甲酸保护 珍 讳 月 芒 症 扒 测 猴 紊 壶 底 鼓 错 灼 劲 悲 帅 级 汲 藉 沾 宿 膳 按 谬 揍 森 奥 悯 迁 喀 竖 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 竹 妄 兢 恼 匆 左 宰 玩 翔 漳 熬 耪 颤 吻 雀 紧 棋 岁 胜 阉 率 泉 旦 刘 恶 慧 椿 者 奖 掌 猾 竹 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章
29、 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 藩 颈 欲 宠 晕 宰 巳 傈 鸟 虹 皱 虾 希 挛 词 读 描 预 毯 撞 弦 塑 玖 嘱 晰 尤 掖 运 缉 矿 呢 晌 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 贾 厨 媚 焊 姚 稚 碑 运 苍 童 歧 煤 彝 疼 蝇 瞬 拥 茧 氦 滥 疼 旗 雇 辣 辐 宣 蚁 哉 愁 玻 售 炬 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件