细胞凋亡检测方法.doc

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1、细胞凋亡检测方法一、细胞凋亡的形态学检测1 光学显微镜和倒置显微镜（ 1） 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，全面皱缩，细胞膜完整但出现发泡现 象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体， 凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围。 贴壁细胞出现 皱缩、变圆、脱落。（ 2） 染色细胞：姬姆萨（Giemsa）染色、瑞氏染色等：正常细胞核色泽均一；凋亡细胞染色质浓缩、边缘化， 核膜裂解、 染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态； 坏死细胞染色浅或没 染上颜色。苏木素-伊红（HE）染色：细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色（凋亡细胞），正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色，坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失。2 荧光

2、显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA 特异性染料有：Hoechst 33342， Hoechst 33258，DAPI。三种染料与 DNA的结合是非嵌入式的， 主要结合在 DNA 的 A-T 碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。Hoechst 是与 DNA 特异结合的活性染料，能进入正常细胞膜而对细胞没有太大细胞毒 作用。 Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。DAPI 为半通透性，用于常规固定细胞的染色。PI和Hoechst33342双标：PI、Hoechst33342均可与细胞核 DNA

3、（或RNA ）结合。但PI 不能通过正常细胞膜， Hoechst 则为膜通透性荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调亡时 细胞膜被破坏，这时可为 PI 着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被 Hoechst 着色，但 是正常细胞核的 Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的 核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。故 PI 着色为坏死细胞；亮兰色，或 核呈分叶状，边集的 Hoechst 着色的为调亡细胞。凋亡细胞体积变小， 细胞质浓缩。 细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期： I期的细胞核呈波纹状（rippled ）或呈折缝样（creased）,部

4、分染色质出现浓缩状态；n a 期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；nb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体 （图1）。3 透射电子显微镜观察凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡1期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构（图2） ； n a期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V 法）磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜内侧，但在细胞凋亡早期，PS可从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面， 暴露在细胞

5、外环境中。 磷脂酰丝氨酸的转位发生在凋亡 早期阶段，先于细胞核的改变、 DNA 断裂、细胞膜起泡。体内的吞噬细胞可通过识别磷脂 酰丝氨酸来清除凋亡细胞。Annexin-V （green）是一种分子量为 3536KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与 PS 高亲和力特异性结合，细胞处于调亡或坏死时， Annexin-V 可为阳性 （早期坏死细胞可能为阴性） ，是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。将 Annexin-V 进行荧光素 （FITC、PE ）或biot in标记，以标记了的 Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧 光显微镜可检测细胞凋亡的发生。PI 和 Annexin-V 双标：碘

6、化丙啶 （propidine iodide, PI） 是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞， PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将 Annexin-V与PI匹配使 用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。*注意：细胞凋亡时其 DNA可染性降低被认为是凋亡细胞标志之一， 但这种DNA可染性降低也可能是因为 DNA含量的降低，或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结果时应该注意。活细胞不能被 Ann exin V-FITC或PI 染色（右图左下象限）。早期凋亡细胞因磷 脂酰丝氨酸的暴露及具有完整细胞膜，故 呈Ann exin

7、V-FITC染色阳性及 PI染色阴 性（右图右下象限）。坏死或晚期凋亡的细 胞呈Ann exin V-FITC 及PI染色双阳性（右 图右上象限）。*注意：未处理的对照细胞进行常规培养的 过程中也有一小部分的细胞死亡发生。三、线粒体膜电位的检测A 仙桃 dot plotFITC LOG FLUORLATE W3P1DTICorWCflOTKCGIuLS凋亡级联反应过程中最早发生的事件,它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）线粒体跨膜电位下降，被认为是细胞出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。线粒体跨膜电位的存在，使一些 亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质，其荧光的

8、增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。名称检测原理3, 3'-Dihexyloxacarbocyanine iodide (DiOC6 )一种有细胞通透性及电压敏感性的亲脂性阳离子 荧光染料，用作膜电位探针，能选择性地染线粒体 及内质网3, 3'-Dihexyloxadicarbocyanine iodide一种有细胞通透性及电压敏感性的亲脂性阳离子 荧光染料，能识别发卡四重结构。也用作端粒酶抑 制剂及抗癌试剂，能在活细胞特异地染色线粒体， 用于线粒体定位及鉴定其氧化能力Rhodami ne 123一种能染活细胞线粒体的有膜通透性的荧光染料， 广泛用于测定线粒体膜电位，能

9、用于检测耐药的肿 瘤细胞的P-糖蛋白的流出活性。JC-1一种阳离子染料，用作线粒体膜电位的指示剂注意事项1. 始终保持平衡染液中pH值的一致性，因为 pH值的变化将影响膜电位。2. 与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白，他们将与部分染料结合，降低染料的 浓度，引起假去极化。四、DNA片断化检测细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩，染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂，形成50300kbp长的DNA大片段，或180200bp整数倍的寡核苷酸片段，在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱 （DNA ladder）。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯 DNA，进 行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡

10、细胞群中可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯 DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT ）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。1. 大分子染色体DNA片段的测定细胞凋亡的早期，染色体断裂成为50300kbp长的DNA大片段。所有超过一定分子量大小的双链 DNA 分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同。线性 DNA 的双螺旋半径超过凝胶半 径时，即达到分辨力的极限。此时凝胶不再按分子量的大小来筛分DNA ， DNA 像通过弯管一样，以其一端指向电场一极而通过凝胶，这种迁移模式称之为 "爬行 &qu

11、ot;。因此，细胞凋亡早 期产生的 50300kbp 长的 DNA 大片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。 通常采用脉冲 电泳技术可圆满地解决这一问题。 这个方法是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。 每当电场 方向改变后，大的 DNA 分子便滞流在爬行管中，直至新的电场轴向重新定向后，才能继续 向前移动。 DNA 分子量越大，这种重排所需要的时间就越长。当 DNA 分子变换方向的时 间小于电脉冲周期时， DNA 就可以按其分子量大小分开。2. DNA Ladder 测定3. 凋亡细胞 DNA 含量的流式细胞计分析4. ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay （CLONTE

12、CH） 优点：敏感度高，适合于检测少量样本，小部分凋亡细胞。如临床活组织检测。五 TUNEL 法 细胞凋亡中 , 染色体 DNA 双链断裂或单链断裂而产生大量粘性 3'-OH 末端，可在脱氧 核糖核苷酸末端转移酶（ TdT ）的作用下将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷 酸酶或生物素形成的衍生物标记到 DNA 的 3'-末端， 从而可进行凋亡细胞的检测， 这类方法 称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（ terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL ）。由于正

13、常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA 的断裂，因而没有 3'-OH 形成，很少能够被染色。 TUNEL 实际上是分子生物学与形态学相 结合的研究方法， 对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色， 能准确地反应细胞凋 亡典型的生物化学和形态特征， 可用于石蜡包埋组织切片、 冰冻组织切片、 培养的细胞和从 组织中分离的细胞的细胞形态测定， 并可检测出极少量的凋亡细胞， 因而在细胞凋亡的研究 中被广泛采用。六、 Caspase-3 活性的检测Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspa

14、se-3正常以酶原（32KD ）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3 由两个大亚基（ 17KD）和两个小亚基（ 12KD ）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋 亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。1 Western blot分析Procaspase-3的活化，以及活化的 Caspase-3及对底物多聚 ADP-核糖 聚合酶poly（ ADP-ribose） polymerase， PARP等的裂解。2 荧光分光光度计分析原理：活化的Caspase-3能够特异切割 D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。根据这一

15、特点， 设计出荧光物质偶联的短肽 Ac-DEVD-AMC 。在共价偶联时， AMC 不能被激发荧光， 短肽被水解后释放出 AMC ，自由的 AMC 才能被激发发射荧光。根据释放的 AMC 荧光强 度的大小，可以测定 caspase-3的活性，从而反映 Caspase-3被活化的程度。3 流式细胞术分析方法：收获细胞正常或凋亡细胞？PBS洗涤，加Ac-DEVD-AMC 3° C反应1h UV流式细胞计分析caspase-3阳性细胞数和平均荧光强度。七、凋亡相关蛋白 TFAR19 蛋白的表达和细胞定位分析TFAR19（ PDCD5），前期的功能研究表明，它是促进细胞凋亡的增强剂。利用荧光

16、素（FITC ）标记的TFAR19单克隆抗体为探针，对细胞凋亡过程中TFAR19蛋白的表达水平TFAR19及定位研究发现， 凋亡早期 TFAR19 表达水平增高并出现快速核转位现象， 伴随着细胞核形 态学的变化，持续较长时间，在凋亡小体中仍然可见。同时我们发现，凋亡早期 蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸（ PS）外翻和细胞核 DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的 核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一。 进一步的研究证明， 凋亡早期 TFAR19 的核转位 具有普遍意义，不同细胞凋亡早期均出现 TFAR19 高表达和核转位。方法：1 悬浮细胞的染色：（1） 收获正常和诱导凋亡的细胞（0.51 &#

17、39; 10） PBS洗2次，lOOOrpm' 10min（2）3%多聚甲醛冰浴 10min , PBS 洗 2 次，lOOOrpm' 10min（3） 加入 PBS-T 溶液，37°C 孵育 15min , PBS 洗 2 次，lOOOrpm' 10min（4）加入 2OOml 胎牛血清，室温反应 3Omin。（5） 加入5ml FITC标记的TFAR19单抗（终浓度为 1 : 40）, 4°C反应30min（6）荧光细胞洗液洗 2次， 1OOOrpm 1Omin。结果观察： 将细胞沉淀滴片, 荧光显微镜及共聚焦激光显微镜下观察 TFAR19 在细

18、胞中的定 位。同时用流式细胞计定量检测 TFAR19 蛋白的平均荧光强度。2：贴壁细胞的原位染色（ 1 ） 贴壁生长的对数期细胞铺在 24 孔或 6 孔板中 （内有洁净盖玻片） ,让其爬片生长, 待长到50%80%满时，凋亡诱导剂处理细胞。（ 2）将不同时间点处理的细胞进行免疫荧光染色,染色步骤同上。（3）将染色的爬片细胞放于一张滴有少量甘油（5ml）的载玻片上，荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜观察 TFAR19 在细胞中的定位。结果观察细胞凋亡检测1、早期检测 :1）PS（磷脂酰丝氨酸）在细胞外膜上的检测2）细胞内氧化还原状态改变的检测3）细胞色素 C 的定位检测4）线粒体膜电位变化的检测2

19、、晚期检测：细胞凋亡晚期中,核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA ,产生大量长度在 18O-2OO bp 的DNA 片段。对于晚期检测通常有以下方法：1）TUNEL（ 末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP 缺口末端标记 ）2）LM-PCR Ladder （ 连接介导的 PCR 检测）3）Telemerase Detection （端粒酶检测 ）3、生化检测：1 ）典型的生化特征： DNA 片段化2） 检测方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记（TUNEL ）等3）TUNEL （末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP 缺口末端标记）4） 通过DNA末端转移酶将带标记的 dNTP（多为dUTP）间接

20、或直接接到 DNA片段的3 '-OH 端,再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。 可做细胞悬液、 福尔马林固定或石蜡处理的 组织、细胞培养物等多种样本的检测。4、LM-PCR Ladder （ 连接介导的 PCR 检测）当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少 （如活体组织切片） 时,直接琼脂糖电泳可能 观察不到核 DNA 的变化。 通过 LM-PCR, 连上特异性接头, 专一性地扩增梯度片段, 从而灵 敏地检测凋亡时产生梯度片段。此外， LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不 同样品可进行比较。如果细胞量很少，还可在分离提纯 DNA 后，用 32P-ATP 和脱氧核糖核 苷酸

21、末端转移酶（ TdT ）使 DNA 标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中 DNA ladder 的形成。上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核 DNA 断裂这一特征，但细胞受到其它损伤（如机 械损伤，紫外线等）也会产生这一现象，因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰。 需结合其它的方法来检测细胞凋亡。其它方法：1）Telemerase Detection （端粒酶检测 ） 端粒酶是由 RNA 和蛋白组成，它可以自身 RNA 为模板逆转录合成端粒区重复序列， 使细胞获得 “永生化 ”。正常体细胞是没有端粒酶活性的， 每分裂一次， 染色体的端粒会缩短， 这可能作为有丝分裂的一种时钟，表明细

22、胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号。研究发现， 90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性。2）mRNA 水平的检测 研究者们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因， 检测这些特异基因的表达水平也成 为检测细胞凋亡的一种常用方法。 据报道， Fas 蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性 T 细胞（ cytotoxic T cells ）等靶细胞。 Bcl-2 和 bcl-X （ 长的 ） 作为抗凋亡（ bcl-2 和 bcl-X ） 的调节物，它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活。用荧光定量 PCR 技术来检测 基因表达水平无疑比之前者更快更准确。通过检测 fas, bax-alpha

23、 和 bcl-X （长的 ） 基因的 mRNA 表达水平来进行细胞凋亡的检测。5、细胞内氧化还原状态改变的检测：正常状态下 ,谷光苷肽 （GSH） 作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂。细胞内有毒的氧化物通过被 GSH 还原而定期去除，氧化型的 GSH 又可被 GSH 还原酶迅速还原。这一反应在 线粒体中尤为重要，许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除。当细胞内 GSH 的排 除非常活跃时， 细胞液就由还原环境转为氧化环境， 这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电 位的降低，从而使细胞色素C （三羧酸循环中的重要组分）从线粒体内转移到细胞液中，启动凋亡效应器caspase的级联反应。6、细胞色素

24、 C 的定位检测细胞色素 C 作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下，它存 在于线粒体内膜和外膜之间的腔中， 凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞浆， 结合 Apaf-1（即optotic protease activating factor-1 ）后启动 caspase级联反应：细胞色素 C/Apaf-1 复合物 激活caspase-9后者再激活 caspase-3和其它下游 caspase7、线粒体膜电位变化的检测：1）线粒体跨膜电位的耗散与细胞凋亡有密切关系2）近年来陆续有报道说明线粒体跨膜电位的耗散早于核酸酶的激活，也早于磷酯酰丝氨酸 暴露于细胞表面。而一旦线粒体跨膜电位耗散，细胞就会进入不可逆的凋亡过程。3）在细胞凋亡过程中线粒体跨膜电位的耗散主要是由于线粒体内膜的通透性转变，这是由于生成了动态的由多个蛋白质组成的位于线粒体内膜与外膜接触位点的通透性转变孔道（PT孔道 ）能稳定线粒体跨膜电位就能防止细胞凋亡。6