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1、离 子 交 换 分 离 纯化 蛋 白 原 理 及 应 用离子交换剂基质主要有树脂、纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和硅胶(HPLC等 离子交换树脂一般只适合分离小分子物质如氨基酸等，不适合分离蛋白质等大分子物 质，一方面是因为大分子不易进入树脂紧密交联结构的内部，另一方面因为交联聚苯乙烯骨架疏水性很强，用于蛋白质分离时，会出现疏水性的不可逆吸附。此外，离子交换 树脂的机械强度较差，而且树脂的体积常随着溶剂离子强度的变化发生溶胀和收缩。 根据交换基团的电荷性质进行分类： 阳离子交换树脂：强酸型含磺酸基团(R-S03H)中等酸型含磷酸基团(-O-PO2H4)弱酸型含酚基、羧基阴离子交换树脂：强碱
2、含季胺基团-N+(CH3)3弱碱含叔胺、伯胺基团-N(CH3)2 阴离子交换树脂对化学试剂及热都不如阳离子交换树脂稳定。弱酸型一只能在碱性pH范围内使用弱碱型一只能在酸性 pH范围内使用 离子交换纤维素的种类很多，可分为阴离子交换纤维素和阳离子交换纤维素两大类。 由于这些材料是纤维状的，大部分活性基团分布在表面，所以，适合于分离蛋白质等生 物大分子。阴离子交换纤维素一DEAE纤维素,具二乙胺乙基，阳离子交换纤维素一CM- 纤维素,具有羧甲基，分别是应用得最广泛的阴离子交换纤维素和阳离子交换纤维素。 另外，根据纤维素颗粒的物理结构不同，可分为“纤维型”和“微晶型”两大类。“微晶型”因颗粒细、比重
3、大，能制成紧密的柱，交换容量大，分辨率高。离子交换凝胶：离子交换葡聚糖凝胶 和聚丙烯酰胺凝胶 具有许多优点，分离大分子物 质，不会引起被分离物质的变性戒失活，非特异性吸附很低；交换容量大(为离子交换纤维素的3-4倍);容易制成微球型，因此装柱和层析时的流速都较易控制。它的缺点 是随着洗脱液的离子强度和pH的变化，床体积变化大，明显影响流速；另外，由于它的 凝胶性质,有时会把大分子物质排阻在网络结构之外。如：葡聚糖(Sephadex)、聚丙烯酰胺(PAG、琼脂糖(Sepharose)平衡缓冲液：它的离子强度和pH的选择首先要保证各个待分离物质如蛋白质的稳定。 其次是要使各个待分离物质与离子交换剂
4、有适当的结合。增强洗脱液与离子交换剂的结合力，降低分离物与离子交换剂的结合力 洗脱缓冲液：在离子交换层析中一般常用 梯度洗脱，通常有改变离子强度和改变pH两 种方式。改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子强度，从而使与离子交换剂结 合的各个组分被洗脱下来；而改变 pH的洗脱，对于阳离子交换剂一般是pH从低到高 洗脱，阴离子交换剂一般是pH从高到低。由于pH可能对蛋白的稳定性有较大的影响， 故一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱。强酸性阳离子 换剂H+的结合力比对Na+的小；H型SPSepharoseFFNacl、NaOH、NH4OH、NH4Cl洗脱磷酸缓冲液平衡弱酸性阳离子交换剂对H+的结合
5、力远比对Na+的大；Na型CM纤维素NAOH或 HCLH或 Na+洗脱强碱性阴离子交换剂对0H-的结合力比对C1-的小得多；0H型弱碱性阴离子交换剂对0H-的结合力比对Cl-的大。Cl型DEAE纤维素Nacl、NaOH乙酸铵（NH4AC、磷酸根（P03-）洗脱Tris-Hcl、磷酸盐缓冲液 平衡。阴离子交换剂碱性碱性缓冲液酸性蛋白 蛋白pl v pH时带负电 阳离子交换剂碱性酸性缓冲液碱性蛋白pl > pH时带正电DEAE纤维阴离子交换剂纯化分离酸性蛋白碱性缓冲液CM纤维素阳离子交换剂纯化分离碱性蛋白酸性缓冲液碱性越强，就越容易被阳离子交换剂吸附 蛋白在pH58稳定时，则应选择阴离子交换
6、剂；蛋白在 pH5以下稳定时，则可选择阳 离子交换剂。阴离子交换剂，pH8.6以下分离中性或酸性物质。阳离子交换剂，一般pH>4条件下使 用，DEAE纤维素吸附酶和蛋白质时常用 pH为79,然后提高盐浓度或降低 pH使之洗脱。CM-纤维素常选在pH4.56.0左右吸附蛋白质，然后提高pH或盐浓度进行洗脱。 例：用离子交换，那首先就要考虑是要阳离子还是阴离子，还有就是你的目的物的PH值蛋白质是pl=6.27阴离子交换，用pH8.0-9.0的缓冲液首先利用缓冲液PH值把目的蛋白给结合到柱子上，然后用合适的盐离子洗脱下来。阴离子交换柱：上样缓冲液20mMTris-HCl，用00.5MNaCl梯度洗脱，流速约2ml/min。 注意：首先是蛋白的等电点是多少选择 pH值，挂柱时pH尽量不要超过pI值的2个点。Nacl的浓度可以设梯度，平衡时用0.1mol之后可以选择0.30.61.2mol的浓度，一般0.6 或1.2就可以洗脱下目的峰。然后蛋白上柱变性了是洗不下来的， 只能用1molNaOH或 8mol脲洗，再生柱子，还有些脂质洗不下来，需要用 30%异丙醇洗柱再生。