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1、现代美人鱼的诞生基因重组 1972年，美国斯坦福大学的 Berg在体外对猿 猴病毒 SV40的DNA 和噬菌体的 DNA 分别进行酶切消化，然后再 用T4 DNA 连接酶将两种消化片段连接 起来，结果获得了包括 SV40和DNA的 重组的杂交 DNA 分子。 1973年，斯坦福大学的 Cohen等人将编码有卡那霉素抗性基因的质 粒与编码有四环素抗性基因的另一种大肠 杆菌质粒重组后，得到了既抗卡那霉 素 又抗四环素的重组体。 重组 DNA 技术 DNA Recombination Technique A 重组 DNA 技术的基本定义 1 基因工程的基本概念 A 重组 DNA 技术的基本定义 B
2、基因工程 的基本定义 C 重组 DNA 技术与基因工程的基本用途 重组 DNA 技术是指将一种生 物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物 体（受 体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表 达出新产物或新性状的 DNA 体外操作 程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组 DNA 技术的三大 基本元件。 B 基因工程的基本定义基因工程 （genetic engineering 实现基因工 程是指重组 DNA 技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部 分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与 构建（即重组 DNA 技 术）；而下游技术则涉及到
3、 基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的 分离 纯化过程。目的分离获得某一目的基因或 DNA 获得目的基因的表达产物 （蛋白质）基因克隆所用的方法及相关的工作，又称重组 DNA 技术。 1大规模生产生物活性物质 C 重组 DNA 技术与基因工程的基本用途 分离、扩 增、鉴定、研究、整理生物信息资源 大规模生产生物活性物质 设计、构建生物的 新性状甚至新物种分分离离工工程程天然细胞天然细胞分离工程分离工程 酶酶天然细胞天然细胞基因工程基因工程蛋白质工程蛋白质工程途径工程途 径工程工程细胞工程细胞发酵工程发酵工程细胞工程细胞工程生物活性物质生 物活性物质酶工程酶工程（二）工具酶工具酶重组 DN
4、A 技术中常用的工具酶 功识别特异序列，切割 DNA 催化 DNA 中相邻的 5磷酸基和 3羟基末端之间形成 磷酸二酯键，使 DNA 切口封合或使两个 DNA 分子或片段连接合成双链 cDNA 分子或片段连接缺口平移制作高比活探针 DNA 序列分析填补 3末端又名 DNA 聚合酶 I大片段，具有完整 DNA 聚合酶 I的 5 3聚合 、 3外5切活性，而 无 53外切活性。常用于 cDNA 第二链合成，双链 DNA 3末端标记等合成 cDNA 替代 DNA 聚合酶 I 进行填补，标记或 DNA 序列分析 催化多聚核苷酸 5 羟基末端磷酸化，或标记探针 在 3羟基末端进行同质多聚物加尾 切除末端
5、磷酸基 能 限制性核酸内切酶 ? 限制性核酸内切酶 ? DNA聚合酶 ? 逆转录酶 ? T4DNA连 接酶 ? 碱性磷酸酶 ? 末端转移酶 ? Taq DNA聚合酶 DNA 连接酶 DNA 聚合酶 Klenow 片段 反转录酶 多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶 限制性内切酶基 因的剪刀 限制性核酸内切酶 （restriction endonuclease识 别 DNA 的特异序列 , 并在识 别位点或其 周围切割双链 DNA 的一类核酸内切酶。 Bam H GGATCC CCTAGG G + GATCC CCTAG G 2连接酶基因工程的针线 （三）目的基因 ? cDNA （comple
6、mentary DNA ? 基因 组 DNA （genomic DNA （四）基因载体 定义 为携带目的基因，实现其无性繁殖或 表达 有意义的蛋白质所采用的一些 DNA 分子。 常用载体 质粒 DNA 噬菌体 DNA 病毒 DNA 克隆载体 （cloning vector 为使插入的外源 DNA 序列被扩增而特 意设计的 载体称为克隆载体。 表达载体 （expression vector 为使插入的外源 DNA 序列可转录 翻译 成 多 肽 链 而 特 意 设 计 的载 体称为 表达 载 体。 质粒 （plasmid 细菌染色体 外 的小型环状双链 DNA 分子。 二、重组 DNA 技术基本原
7、理 目的基因的获取 克 隆载体的选择和构建 外源基因与载体的连接 重组 DNA 导入受体菌 特点 : 能在宿主 细胞内独立自主复制；带有某些遗 传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。 重组体 的筛选 克隆基因的表达 3以质粒为 载体 的 DNA 克隆 过程 （一）目的基因的获取 1. 化学合成法 已 知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨 基酸序列 。 2.基因组 DNA 文库 （genomic DNA library 3. cDNA 文库（cDNA library 4. 聚合酶链反应 （polymerase chain reaction, PCR 1. 化学合成法 2. 基因组 DNA 文库 组
8、织或细胞染色体 DNA 存在于转化细菌内 由克隆载体所携带的所 有基因组 DNA 的集合 限制性内切酶 基因片段 克隆载体 重 组 DNA 分子 受体菌 由已知氨基酸序列推测可能的 DNA 序列 含重组分子的转化菌 3. cDNA文库 mRNA 反转录酶 cDNA 复制 双链 cDNA 载体 重组 DNA 分子 受体菌 cDNA 文库 SI核酸酶 AAAA 逆转录酶 AAAA TTTT 4. 聚合酶链反应（ PCR） 是一种在体外利用酶促反应大量获 得特异序列的基因组 DNA 或 cDNA 的专 门技术， 又称为无细胞的分子克隆。 碱水解 TTTT DNA 聚合酶 4PCR的反应体系 模板 D
9、NA 引物 4种dNTP Taq DNA 聚合酶 含 Mg2+的缓冲 液。 PCR的基本反应步骤及原理 （1）变性，加热至 95 ，使模板 DNA 解开成 单链； （2）退火，温度降至适宜，使引物与模板互补结 合； （3）延伸，温度升 至 72 ，DNA 聚合酶以 4种 dNTP为底物，在引物的 3'-OH 上，合成与模板互 补的 DNA 新链。 PCR 反应条件 （二）克隆载体的选择和构建 变性 95?C （三）外 源基因与载体的连接 1. 粘性末端连接 方式： （1同一限制酶切位点连接 （2不同限制 酶切位点连接 延伸 72?C 退火 Tm-5?C 同 一限 制酶 切 位 点 连
10、接不同限制酶切位 点的连接 GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用 Bam H切割 G CCTAG G CCTAG Bam H 切割反应 Eco R切割位点 GATCC G 载体 DNA 用 Bam H切割 GAATTC CTTAAG Bg l 切割位点 AGATCT TCTAGA GAATTC CTTAA G AGATCT TCTAGA EcoR + Bg l 双酶切 AATTC G A TCTAG Eco R + Bg l AATTC G GATCT A 双酶切 + GATCC G GATCC G + AATTC G A TCTAG GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG T4 DNA 连接酶 15oC T4 DNA 连接酶 15oC GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG GAATTC CTTAA G AGATCT TCTAGA 载体自连 重组体 目的基因自连 重组体 配 伍末端的 连接情况和同一 限制酶切位点连 接相似。 5Eco REco REco RCCGAATTCGGGCTTAAGCOMI OaaI Ou a»uoow. ra w LW 一- X"X “ A E“ *_ «S«1XMifi-hhbb:=;|七門IOBSBHB