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1、实验一生活污水 (含药厂废水) 的细菌学检查 (综合性实验)实验目的：1. 学习水样的采取方法和水样中细菌总数测定的方法2 了解水源水的平板菌落计数的原则3.了解 PCR 技术监测污染水体大肠埃希菌的意义和基本原理4掌握 PCR 操作技术实验材料：1培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。2材料 水样3仪器及其他用具 恒温培养箱、三角烧瓶，带玻璃塞瓶，培养皿，移液器( 1mL )，移液 管(1mL )，试管等， PCR仪，水浴锅，培养箱，电泳仪，自动微量移液器(各型号)，滤膜，PCR 管，离心管， Whatman 3MM 滤纸或相当产品。4. 试剂及溶液 含有适当抗菌素的 LB 培养基， Taq DN
2、A 聚合酶，正向引物 (20 mol/L ) 及反 向引物 (20 mol/L )溶于水中， DNA 分子量标准，乙酸铵( l0mol/L )，无水乙醇，TSEL (50mmol/L Tris-HCl ，pH8.0，20%蔗糖， 50mmol/L EDTA ，1 g/ l 溶菌酶)，SSK (50mmo1/L NaCl, 1%SDS, 3mg/mL 蛋白酶 K) ，TE 缓冲液，l0 ×扩增缓冲液 (500mmol/L KCl ，100 mmol/L Tris-HCl ，15mmol/L ，MgC1 2)。4 种 dNTP 贮存液( 20mmol/L ，pH8.0 ) ，琼脂糖溶液
3、(0.7%)，电泳缓冲液 (1×TAE)，溴 化乙锭染色液， 6×凝胶上样缓冲液。4.仪器及其他用具实验原理：本实验采用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。 由于水中细菌种类繁多， 它们对营养 和其他生长条件的要求差别很大， 不可能找到一种培养基在一种条件下， 使水中所有的细菌 均能生长繁殖。 因此， 以一定的培养基平板上生长出来的菌落计算得到的水中细菌总数仅是 一种近似值。目前一般是采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基测定水中细菌总数。PCR大肠埃希菌( Escherichia coli )是指示粪便污染的重要指示物。当水体中出现大量的E.coli 就说明近期内水体受到了粪便污染(因
4、其脱离寄主后，其半存留期会大大缩短) 检测这种微生物非常灵敏，即使每 100mL 水中只有一个个体，也能被检验出来。实验内容：(一)细菌总数测定自来水(1) 用灭菌移液管或移液器吸取 lmL 水样，注入灭菌培养皿中。(2) 分别倾注约 15mL 已融化并冷却到 45左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即在 桌上作平面旋摇，使水样与培养基充分混匀。(3) 另取一空的灭菌培养皿，倾注牛肉膏蛋白胨琼脂培养基15mL ，作空白对照。(4) 培养基凝固后，倒置于 37温箱中，培养 24h，进行菌落计数。两个平板的平均菌 落数即为 lmL 水样的细菌总数。池水、河水或湖水等(1) 稀释水样：取3个灭菌空试管
5、， 分别加入 9mL 灭菌水。取lmL 水样注入第一管 9mL 灭菌水内、摇匀，再自第一管取 lmL 至下一管灭菌水内，如此稀释到第三管，稀释度 分别为 10-1， 10-2 与 10-3。稀释倍数看水样污染程度而定，以培养后平板的菌落数在 30300 个之间的稀释度最为合适，若三个稀释度的菌数均多到无法计数或少到无法计 数，则需继续稀释或减小稀释倍数。一般中等污染水样，取10-1，10-2,10-3 三个连续稀释度，污染严重的取 10-2，10-3，10-4 三个连续稀释度。(2) 自最后三个稀释度的试管中各取 1mL 稀释水加入空的灭菌培养皿中。每一稀释度做 两个培养皿。(3) 各倾注 1
6、5mL 己融化并冷却至 50左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，立即放在桌上 摇匀。(4) 凝固后倒置于 37培养箱中培养 24h.。菌落计数方法(1) 先计算相同稀释度的平均菌落数。 若其中一个平板有较大片状菌苔生长时， 则不应采用， 而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。(2) 选择平均菌落数在 30300 之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则 以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数。(3) 若有两个稀释度的平均菌落数均在 30300 之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若 其比值小于 2，应采取两者的平均数；若大于 2，则取其中较小的菌落总数。(4) 若所
7、有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数。(5) 若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。(6) 若所有稀释度的平均菌落数均不在30300 之间，则以”近 300 或 30 的平均菌落数乘以稀释倍数。(二)应用 PCR技术监测污染水体大肠埃希菌1水样的处理及模板 DNA 的制备(1) 取水样 lmL ，低速 (2 000 r/min ) 离心 5min ，以除去不溶性杂质。 取出上清， 经 6 000 r/min 离心 5min ，收集菌体。(2) 将菌体悬于 100 lTSEL 溶液中，置 37水浴作用 30 min 。
8、(3) 向反应混合物中加入 300 l SSK 溶液，置 37继续作用 60 min。(4) 向反应混合物中加入 2 倍体积的无水乙醇， 摇匀后置 -20，2h. 12 000 r/min 离心 15 min ， 收集沉淀，室温晾干后将沉淀物溶于 100300 l 无菌去离子水或 TE 缓冲液中备用。 如果是纯培养的菌落， 即将菌落挑入 100 l 无菌去离子水中， 加热煮沸 lmin ，即可作为 PCR 模板。2引物设计本实验的引物来自 E. coli 的 lac Z 和 lam B 基因。lac Z 引物 1：ZL-1675 (5'-ATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCC
9、-3' )引物 2： ZR-2025 ( 5'-GGTTTATGCAGCAACGAGACGTCA-3' )lam B 引物 1：BL-4910(5'-CTGA TCGAATGGCTGCCAGGCTCC-3' )引物 2：BR-5219 (5'-CAACCAGACGATAGTTA TCACGCA-3' )3 PCR 扩增体系按以下次序，将各成分加在 0.5mL PCR 薄壁管内混合：l0 ×扩增缓冲液 5 l20mmo1/L 4 种 dNTP 混合液( pH8.0 )1 l20 mo1/L 正向引物 2.5 l20 mo1/L 反向引物 2.5 l模板 DNA 510 lTaq DNA 聚合酶 12 单位补足 H2O 至总体积 50 l4PCR 循环。依扩增产物按以下方法进行 PCR 扩增，典型的程序有变性、复性和聚合（延伸反应） 大小与引物碱基组成来确定时间与温度。 时间与温度会影响到产物的特异性。 具体参数需摸 索。5扩增产物的检测和分析如果扩增产物大小与其他非特异性 DNA 片段相差很大，则可直接电泳，通过大小来 判断；如果扩增产物中有特异性限制酶切位点，则酶切后电泳，由其大小来判断。