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1、无菌检查方法学验证1. 概述将规定量的供试品按无菌检查法中的薄膜过滤法进行操作 ,并接种小于 100cfu 的试验菌 ,同时设置阳性对照 ,按规定温度培养 35 天,与各相应的阳性对照管比较 : 如含供试品各管中的试验菌均生长良好 ,则供试品的该检验量在该检验条件下无抑 菌作用 ,可按此法进行供试品的无菌检查 ;如含供试品的任一管中的试验菌生长微 弱、缓慢或不生长 ,则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用 ,应采用增 加冲洗量或使用中和剂等方法消除供试品的抑菌作用 ,并再重新进行验证试验。2. 验证前提条件供试品的选择原则 :相同配方 ,不同规格的制品 ,选择其中装量最大的制品进行验
2、证。种类相同 ,含量不同的制品 ,选择含量最高的制品进行验证。照此原则 ,多规格制 品按下表选择供试品进行验证。3. 验证方法3.1菌液制备3.1.1细菌菌液制备程序 取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的冻干菌种管各一支,分别在无菌操作下打开 ,以毛细吸管加入适量营养肉汤 ,轻柔吹吸数次 ,使菌种融化分散 后 ,吸出滴入营养琼脂斜面上 ,使均匀分布 ,置 3035培养 18h24h。用接种环取适 量第 1代培养菌苔 ,划线接种于营养琼脂培养基斜面上 ,于 3035培养 18h24h。 同法操作 ,培养得第 3 代培养物。 取生孢梭菌的冻干菌种管一支 ,在无菌操作下打开 ,以毛细吸管加
3、入适量营养 肉汤 ,轻柔吹吸数次 ,使菌种融化分散后 ,吸出滴入胃酶肉肝疱斜面上 ,使均匀分布 ,置 3035培养 18h24h。用接种环取适量第 1代培养菌苔 ,划线接种于胃酶肉肝疱斜 面上,于 30 35培养 18h24h。取生孢梭菌的第二代新鲜培养物至硫乙醇酸盐流 体培养基中 ,3035培养 18h24h,得第 3 代培养物。 分别取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的第 3 代营养琼脂斜 面新鲜培养物 ,用 5.0ml吸管吸取 3.0ml5.0ml稀释液加入斜面试管内 ,反复吹吸 ,洗 下菌苔。随后用 5.0ml 吸管将洗液移至另一无菌试管中 ,用电动混合器混合 20s,或在
4、手掌上振敲 80 次,以使细菌悬浮均匀 ,得初步菌悬液。 取初步制成的上述菌悬液和生孢梭菌第 3代新鲜培养物 ,用 0.9%无菌氯化钠 溶液稀释至不高于标准比浊管的浓度 ,即得每 1ml 含菌数小于 100cfu验证细菌菌 液。3.1.2孢子悬液制备程序取白色念珠菌和黑曲霉的冻干菌种管各一支 ,分别在无菌操作下打开 ,以毛细 吸管加入适量营养肉汤 ,轻柔吹吸数次 ,使菌种融化分散后 ,吸出滴入改良马丁琼脂斜 面上,使均匀分布 ,置2328培养 57天。用接种环取适量第 1代培养菌苔 ,划线接 种于改良马丁琼脂斜面上 ,同上述条件培养得第 2代培养物。取第 2代培养物 ,同法 操作 ,得第 3
5、代培养物。用 5.0ml 吸管吸取 3.0ml5.0ml0.9%无菌氯化钠溶液加入上述第三代新鲜斜 面试管内 ,反复吹吸,洗脱孢子 ,用管口带有薄的无菌棉花或纱布的毛细吸管吸出孢子 悬液至无菌试管内 ,用 0.9%无菌氯化钠溶液稀释至不高于标准比浊管的浓度 ,即得每 1ml 含菌数小于 100cfu 验证孢子悬液。3.2 薄膜过滤3.2.1供试品试验组取规定量供试品 ,按无菌检查标准操作细则薄膜过滤后 ,如为不含防腐剂供 试品,则往其中一只滤筒内接入 100ml 改良马丁培养基 ,往另一只滤筒内各接入 100ml的硫乙醇酸盐流体培养基 ,用5ml 灭菌注射器抽取 1ml验证菌液 ,从集菌培养
6、器胶管处注入培养基中 ;如为含防腐剂供试品 ,则待供试品过滤完后 ,连续 3 次用 0.1%蛋白胨水溶液冲洗滤膜 ,每张滤膜每次冲洗量为 100ml,在最后一次冲洗液中 ,加 入 1ml 验证菌液。每种制品抽取三批按上法操作。3.2.2阳性对照组取一套与供试品试验组相同的集菌培养器 ,不过滤供试品 ,直接向与供试品试验 组相等量的培养基内接入 1ml 的验证菌液。3.2.3阴性对照取规定量供试品 ,按无菌检查标准操作细则薄膜过滤后 ,往其中一只滤筒内 接入 100ml 改良马丁培养基 ,另一只滤筒内接入 100ml硫乙醇酸盐流体培养基。7.3.3.4培养将硫乙醇酸盐流体培养基置于 3035培养 ,改良马丁培养基置于 2025,分 别在培养的第 1、2、3、4、5 天观察并记录结果。7.3.3.5可接受标准所有验证用试验菌种均能在供试品组和阳性对照组中生长良好 ,并且同一试验 菌在供试品组和阳性对照组中生长的时间及强弱应没有明显差异。阴性对照应无菌 生长。各品种三批验证结果均应符合上述要求。