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1、基于新型分子信标和胸腺嘧啶 一汞(H)配位作用的DNA和Hg( 2+) 检测技术研究【摘要】：随着人类基因组计划的完成，科学工作者的研究重心开始由 单纯的获取和收集基因组信息向通过基因信息分析对生命过程做出 预报和新发现转移。因此，在后基因组和蛋白质组时代，迫切需要发展 高灵敏、高选择性的定量研究基因组信息的工具。分子信标就是最理想的工具之一。因其独特的性质和多功能性，分子信标已被广泛应用于核酸的实时定量检测、活体分析、化学与生物传感器、疾病诊断等 领域。为满足不同的需要，在经典分子信标的基础上，人们设计了许多 新型的分子信标。分子信标的迅速发展，为基因组和蛋白质组研究、 疾病的分子诊断以及新
2、药开发提供了一个平台。鉴于汞离子对环境和人类健康的危害，发展简单、快速、低成本的汞离子检测技术对生命、 环境、医学以及工农业生产等都具有重要的意义。核酸的结构和功能对重金属离子非常敏感，因此，构建基于核酸的汞离子生物传感器引起 人们的关注。近年来，有人报道核酸中thymine能与汞离子特异性结合， 形成T-Hg2+-T配合物。之后,T-Hg2+-T配合化学成为构建汞离子生物 传感器研究的热点。本文主要致力于 DNA检测的新型分子信标的设 计和基于T-Hg2+-T配位作用的新型汞离子检测技术的构建。具体内 容如下：第一章绪论首先系统介绍了分子信标的发现及应用研究，包括分子信标结构、工作原理、优化
3、设计及应用现状。接着介绍了基于 T-Hg2+-T配位作用的汞离子生物传感器的研究进展。最后阐述了本论文设计思路和研究意义，指出论文的创新之处。第二章基于电活性- 非电活性转换分子信标直接均相检测 DNA本章设计了一种新型的电 化学分子信标，即 电活性-非电活性转换分子信标”直接用于均相检 测DNA。该电化学分子信标由一段 3'、5'端标记有电化学标记物 胭脂红酸，自身能够形成茎-环结构的单链寡核苷酸组成(简称为CAs-MB)。CAs-MB在关闭状态时，两端标记的胭脂红酸单体在茎部 互补序列的作用下相互接近，并形成二聚体,从而导致电化学信号的淬 灭；与完全互补目标DNA序列杂交时
4、，CAs-MB将发生构象转换，即由 自由卷曲的茎-环结构转换为刚性的DNA双链,胭脂红酸二聚体变为 单体，从而恢复了胭脂红酸单体的电信号。CAs-MB的电化学信号强度与完全互补目标DNA序列的浓度在0.06-1.4范围内成良好线性关系，相关系数为0.998检出限为30nM。该电化学分子信标能够像传 统的荧光分子信标一样有效地识别单碱基错配。CAs-MB有望直接应用于精确地基因分析。第三章基于非标记分子信标修饰的金胶纳米探 针的非交联性聚集比色检测单核苷酸多态性基于非标记分子信标 (Label-freemolecularbeacon,LMB)修饰的金胶纳米颗粒(AuNPs)的非交 联聚集，本章构
5、建了一种新型比色检测单核苷酸多态性的方法。该方 法将茎-环结构的分子信标高特异性识别力和金胶纳米颗粒聚集变色 的光学特性有机结合在一起，实现了单核苷酸多态性的比色检测。利 用金胶纳米的自组装技术将巯基修饰的分子信标探针固定到金胶表 面制备分子信标修饰的金胶纳米探针 (AuNPs-LMB)。当AuNPs-LMB 与不同的目标序列(野生型或突变型)杂交时，金胶表面的LMB的构象yiT论女第表站家由茎-环结构转换为具有一定刚性的双链并引起金胶体系熵、焓的差 异性；在适当盐度条件下，AuNPs-LMB对不同目标序列的识别导致金 胶纳米颗粒不同程度的聚集，从而实现对SNPs的识别。将该比色传感 体系应用
6、于P53基因的单核苷酸多态性的检测，结果令人满意。第四 章基于多胸腺嘧啶寡核苷酸修饰的金电极高灵敏伏安检测汞离子利 用胸腺嘧啶(thymine,T)与汞离子的高亲和识别作用和电化学溶出技 术,本章设计了一种具有高灵敏度和高选择性的汞离子生物传感器-多 胸腺嘧啶寡核苷酸修饰的金电极即Polythymineoligonucleotide/Au电极(PTO/Au 电极)。将一段巯基修饰的 polythymineoligonucleotide(5 -SH-T15-3'通过 Au-S 键自组装到金电 极表面上，然后用巯基己醇封闭电极表面即得到PTO/Au电极。利用PTO/Au电极上DNA序列中的
7、碱基T与Hg2+特异性结合的作用选择 性把 Hg2+富集于电极表面，缓冲液洗涤几次后，在 IOmMHEPES(pH7.2,1MNaCIO4)溶液中将富集的 Hg2+电化学还原成 Hg,然后进行阳极溶出伏安扫描测定汞的氧化电流信号。此修饰电极 对Hg2+的响应在0.2-1 nmol/L范围内成良好的线性关系，相关系数为 0.9953检测限达60pM。另外，此修饰电极在Zn2+、Pb2+等其他六种 二价金属离子的存在下并不干扰对 Hg2+的检测 (nM2+:nHg2+=200:1)。与传统的电化学溶出检测汞离子的方法相 比,PTO/Au电极展现了良好的灵敏度和选择性，是一种新型高效的检 测汞离子的
8、 绿色”化学修饰电极。第五章基于汞特异性DNA修饰的金胶纳米探针的比色传感器简便快速检测汞离子本章制备了一种汞特异性 DNA(mercury-specificDNA,MSD)修饰的金胶纳米(Au-MSD) 比色探针。该探针通过汞离子操纵修饰在金胶表面的汞特异性DNA的构象转换来调节金胶抵抗盐诱导聚集的能力，从而实现汞离子的简 便快速的比色检测。溶液中不存在汞离子时，修饰在金胶表面的汞特异性DNA以随意卷曲的单链构象存在，当再加入一定浓度的MgCI2 时,该探针会因为金胶颗粒彼此间的静电排斥力的急剧降低而迅速聚 集；相反,溶液中存在汞离子时，汞离子特异性DNA识别汞离子并发 生一个由自由卷曲的单
9、链构象向汞介导的发卡型”刚性双链的转换过程,这些在金胶表面形成的刚性双链大大提高了金胶抵抗盐诱导聚 集的能力，致使同样的盐浓度下金胶也不会发生聚集；伴随着上述变 化过程，金胶溶液的颜色也由紫红色转变成酒红色，而溶液颜色的变化 程度与汞离子的浓度相关。此纳米比色探针对OuM-IOM浓度范围内的汞离子产生良好的响应，检测限为60nM(S/N=3)，并应用于实际水 样中汞离子的检测。第六章基于三聚硫氰酸修饰的金胶纳米探针的比 色传感系统简便快速检测汞离子本章利用汞离子的亲巯基性和金胶 纳米颗粒的独特光学性质，建立了一种基于三聚硫氰酸(TCA)修饰的 金胶纳米探针(TCA-AuNPs)的简单、快速检测
10、汞离子的比色传感方 法。表面覆盖有柠檬酸三钠的金胶纳米颗粒与三聚硫氰酸通过配体交 换反应制备TCA-AuNPs。TCA分子中的巯基使金胶纳米颗粒表面带 有较高密度的负电荷，因而TCA-AuNPs之间相互排斥,所以 TCA-AuNPs能够稳定分散在溶液中，溶液颜色呈现酒红色。一旦在 TCA-AuNPs溶液中加入一定量的 Hg2+,TCA-AuNPs表面的巯基就会与Hg2+配位,导致金胶纳米颗粒的快速聚集，溶液的颜色也由酒红色 瞬间变为蓝灰色。金胶纳米颗粒的聚集程度与加入的Hg2+的浓度相关。本章详细探讨了TCA组装密度、不同pH的缓冲介质对TCA-AuNPs检测汞离子的灵敏度的影响。在优化的实验
11、条件 下,TCA-AuNPs 对 Hg2+的吸光度比值响应分别在 0-1.7 卩 M(y=0.0568x+0.2312,R2=0.9863)和2.0-6.5 卩 M(y=0.2084-X).2551,R2=0.9739)范围内呈良好的线性关系，最 低检测限为50nM(S/N=3)。当加入的金属离子浓度为70讪时,除Pb2+ 外,Cd2+等其它9种金属离子均不干扰 TCA-AuNPs对Hg2+的检测, 而Pb2+的干扰可以通过加入掩蔽剂吡啶 -2,6-二甲酸(PDCA)加以消 除。TCA-AuNPs制备简单,识别汞离子的速度快，而且具有较高的灵敏 度高和较好的选择性。因此,该比色传感系统为快速检
12、测 Hg2+提供了 一种新途径。【关键词】：分子信标构象转换金胶纳米颗粒汞胸腺嘧啶 -汞配位生物传感器【学位授予单位】：华东师范大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2010【分类号】：R341【目录】：摘要6-10Abstract10-20第一章绪论20-531分子信标技术研yiT论女為表&冢究20-381.1分子信标的结构和工作原理 20-221.1.1分子信标的结构 20-211.1.2分子信标的工作原理21-221.2分子信标的理论基础和设计22-24121能量转移与 MB设计221.2.2热力学特性与 MB设计 22-231.2.3动力学特性与 MB设计23-241.3分子
13、信标的优化设计 24-341.3.1基于提高灵敏度的 MB优化设计24-271.3.1.1淬灭基团的 优化24-261.3.1.2荧光基团的优化26-271.3.2基于提高稳定性的MB 优化设计27-301.3.2.1基于骨架碱基修饰的 MB281.3.2.2基于茎部修 饰的MB28-301.3.3基于不同信号传导机制的 MB设计30-341.3.3.1双 荧 光基团(Two-dye)MB30-311.3.3.2 激发体-单 体转换 (Excimer-MonomerSwitching)MB311.3.3.3 缔合型 MB31-321.3.3.4 荧光 波长转移型 MB321.3.3.5双重荧光
14、共振能量转移 (Dual-FRET)MB32-331.3.3.6固定化电化学 MB33-341.4分子信标的应 用 34-381.4.1 核酸检测 34-371.4.1.1 实时监测 PCR34-351.4.1.2DNA 粘 性末端配对分析(DNASticky-EndPairing,SEP)35-361.4.1.3 基因分型和 突变检测361.4.1.4活细胞中RNA检测和成像36-371.4.2蛋白质和小 分子检测371.4.3生物芯片与生物传感器37-382基于胸腺嘧啶-汞(II) 配位作用的汞离子检测技术研究 38-462.1汞的危害及其检测38-392.2 基于胸腺嘧啶-汞(I)配位作
15、用的汞离子检测技术研究 39-462.2.1基于 T-Hg(2+)-T的荧光传感器39-412.2.2基于T-Hg(2+)-T的金胶纳米比 色传感器41-442.2.3基于T-Hg(2+)-T的电化学传感器44-463本论文 的设计思路及研究意义46-47参考文献47-53第二章基于电活性-非电活性转换分子信标直接均相检测DNA53-661引言53-552实验部分yiT论女第表站赢55-572.1 试剂 55-562.2 仪器 562.3CAS-MB 的制备 562.4native-MB 和 CAs-MB熔链温度的紫外测定562.5电化学检测56-572.6杂交与检测 573结果与讨论57-6
16、43.1CAS-MB的表征57-613.1.1CAS-MB的红外光 谱表征57-583.1.2CAS-MB的紫外可见光谱和电化学表征 58-603.1.3CAS-MB的电化学热熔曲线60-613.2杂交条件的优化61-633.3CAS-MB的对目标DNA的特异性识别63-643.4CAS-MB对完 全互补目标DNA的定量检测644结论64-65参考文献65-66第三章 基于非标记分子信标修饰的金胶纳米探针的非交联性聚集比色检测单核苷酸多态性66-811引言66-682实验部分68-722.1仪器682.2试 剂68-692.3DNA结构的预 测69-702.4金胶纳米颗粒的制备 70-712.
17、5AuNPs-LMB探针的制备712.6金胶表面LMB组装密度的估 算712.7比色检测71-723结果与讨论72-793.1LMB组装密度的估算 723.2MgCI_2 浓度的优化 72-763.3AuNPs-LMB 识别 SNPs 的能力 76-773.4SNPS定量检测77-783.5对P53基因序列的检测78-794结论 79参考文献79-81第四章基于多胸腺嘧啶寡核苷酸修饰的金电极高 灵敏伏安检测汞离子81-921引言81-832实验部分83-842.1试剂与仪 器 832.2 实验过程 83-842.2.1PTO/AU 电极的制备 83-842.2.2Hg(2+) 的伏安检测过程8
18、43结果与讨论84-903.1PTO/AU电极的表征84-863.1.1PTO/AU电极制备的表征 84-853.1.2PTO/Au电极伏安检测 Hg(2+)电化学响应表征85-863.2实验条件的优化86-883.2.1电极表 面的PTO组装密度863.2.2捕获Hg(2+)的时间86-873.2.3电化学还 原Hg(2+)的时间87-883.3PTO/AU电极的重现性、线性关系和检测yiT 论女域表家限88-893.4PTO/AU电极的选择性89-904结论90参考文献90-92第五 章基于汞特异性DNA修饰的金胶纳米探针的比色传感器简便快速检测汞离子92-1071引言92-942实验部分
19、94-962.1试剂942.2仪器942.3 金胶纳米颗粒的制备94-952.4AU-MSD探针的制备952.5Hg(2+)的比 色检测95-962.6实际水样的处理963结果与讨论96-1043.1金胶纳米 颗粒的微观形态963.2AU-MSD与Hg(2+)作用的紫外可见光谱跟踪 检测 96-973.3MgCI_2 浓度的优化 97-993.4Au-MSD 与 Au-MSD-Hg 的 抗盐诱导聚集稳定性的直接比较99-1023.5Hg(2+)的定量测定 102-1033.6AU-MSD对Hg(2+)的特异性和选择性1033.7实际样品检 测103-1044结论104参考文献104-107第六
20、章基于三聚硫氰酸修饰 的金胶纳米探针的比色传感系统简便快速检测汞离子107-1211引言107-1092实验部分109-1102.1试剂1092.2仪器1092.3金胶纳米颗粒 的制备及表征1092.4TCA-AuNPs探针的制备109-1102.5Hg(2+)的比 色检测1103结果与讨论110-1183 .仃CA-AuNPs探针的紫外可见光谱 表征110-1113.2TCA-AuNPs探针比色检测Hg(2+)的可行性验证111- 1123.3实验条件的优化112-1153.3.1不同pH缓冲溶液的优化112- 1143.3.2金胶纳米颗粒表面TCA组装密度的优化114-1153.4定量 比色检测Hg(2+)115-1173.5TCA-AuNPs探针的选择性117-1184结论 118-119参考文献119-121附录:博士在读期间科研成果121-122致谢 122-123 本论文购买请联系页眉网站。