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1、朊病毒结构研究和致病机理分析摘要朊病毒病是人和动物的一种退行性脑病，主要包括羊骚痒病，疯牛病，以及人的克雅氏综合症等。其致病因子被认为是一种由正常细胞PrP蛋白经非正常折叠所形成的蛋白质（PrPsc）。PrPsc和PrPc来自于同一基因具有相同的氨基酸序列，但在二级结构和三级结构上有很大的不同。科学界认为朊蛋白是一种不含核酸和脂类的疏水性糖蛋白关键词：朊病毒 PrPc PrPsc 重组朊蛋白 高级结构 朊病毒（Prion Protein , PrP）是一种蛋白质亚病毒，是只有蛋白质而没有核酸的病毒，形态特征为小型蛋白质颗粒，大约有250个氨基酸组成，大小仅为最小病毒的1%。它是由动物机体中高度
2、保守的朊病毒蛋白基因编码的蛋白质并能在机体的多种细胞中表达，在中枢神经系统及神经元细胞中表达量最高。朊病毒具有两种不同的分子构象：一种是存在于正常机体或感染动物的细胞中，没有致病作用，称为细胞朊蛋白（PrPc）,另一种是仅存在于感染动物的细胞中，称为朊病毒蛋白（PrPsc）。两种蛋白的一级结构完全相同，但二极结构及高级结构则有着显著差异。此种病毒可导致库鲁病（Ku-rmm）、克雅氏综合症（CJD）、格斯特曼综合症（GSS）、致死性家族失眠症（FFI）等常见人类疾病以及羊瘙痒病和疯牛病等动物疾病1。朊病毒的传播途径包括：使用动物肉骨粉饲料、牛骨粉汤；医源性感染，如使用脑垂体生长激素、促性腺激素和
3、硬脑膜移植、角膜移植、输血等。朊病毒特点是耐受蛋白酶的消化和常规消毒作用，由于它不含核酸，用常规的PCR技术还无法检测出来。朊病毒的复制并非以核酸为模板，而是以蛋白质为模板。斯坦利由于发现PrPSC（一普里朊）和PrPC具有相同的一级结构而具有不同的二级和三级结构，打破了以往蛋白质的一级结构决定高级结构的定律，而获得了1997年诺贝尔生理学或医学奖2。1982年普鲁宰纳提出了朊病毒致病的“蛋白质构象致病假说”，以后魏斯曼等人对其逐步完善。其要点为：1、朊病毒蛋白有两种构象：正常型PrPc和致病型PrPsc，两者的主要区别在于其空间构想上的差异。PrPc仅存在螺旋，而PrPsc有多个折叠存在，后
4、者溶解度低，且抗蛋白酶解；2、PrPsc可胁迫PrPc转化为PrPsc，实现自我复制，并产生病理效应；3、基因突变可导致细胞型PrPc中的螺旋结构不稳定，至一定量是产生自发性转化，片层增加，最终变为PrPsc型，并通过多米诺效应倍增致病3。朊病毒的一级结构PrP前体全长为253个（人）264个（牛）氨基酸，分子质量为3335KD。 PrP前体的N端的22个疏水氨基酸残基为信号肽序列。C端的23个（人为22个）疏水氨基酸残基是糖基磷酸肌醇结合位点（GPI）。这两部分将通过翻译后修饰水解除去，因此人的成熟PrP仅为中间的第23位第231位氨基酸共209个残基组成的序列。N端的2395位氨基酸残基之
5、间有一个富含组氨酸和甘氨酸的八肽重复区（PHGGGWGO）（5191位氨基酸），第96112位氨基酸序列是PrP的结构控制区，113135位有一段跨膜区，135231位之间是3个束状螺旋区域4。 成熟的PrP分子有两个N型糖基化位点，分别为第181位和第197位的两个天冬酰胺（Asn）残基，在第179位和第214位的两个半胱氨酸（Cys）残基之间有一个二硫键，第183位和第192位的2个苏氨酸（Thr）磷酸化序列一致，第145位的酪氨酸（Tyr）被硫化，第155位的酪氨酸是其磷酸化位点之一（除灵长类及啮齿类动物之外），第147位第163位的氨基酸之间有一芳烃回文序列。 此外PrP含有3组不同的
6、短肽重复，第一组为6肽重复结构；第二组为8肽重复结构（PHGGGWGQ）（其中第一个重复是9肽：PQGGGGWGQ）；第三组是2个肽的串联重复，与前面所提到的芳烃回文序列部分重合，所有这些重复似乎为PrP独有2。研究发现PrP序列中的糖基化位点，形成二硫键的Cys位点和疏水的跨膜区最为保守。其次为N端的信号肽水解位点，C端的糖基磷酸肌醇结合位点（GPI）和螺旋结构区域的序列，八肽重复序列极为保守，均为P（H/Q）GGG（G/-）WGQ，但不同物种之间的重复拷贝数有所不同。PrP经过蛋白酶K水解后，其正常的PrPc被完全水解掉，而有侵染特性的PrPsc则被水解掉N端的67个氨基酸残基和C端的25
7、个氨基酸，变为分子质量只有2730KD的PrP2730。据研究推测蛋白酶K的N端切点位于富含G的八肽重复区域，在8990位点的G-W间的肽键断裂。这种具有抗蛋白酶K功能的PrP27-30（PrP-res）的出现被认为是朊蛋白病毒致病的关键5。一般认为PrPc三维结构形似“风筝”，其N端存在着缺乏有序结构的片段，这一结构片段高度柔顺，可以在溶液中随意摆动，犹如风筝的“尾巴”，在其C端则含有3个螺旋，2个反向平行的-折叠及一个二硫键，有多处被糖基化、磷酸化、硫基化等化学修饰的氨基酸位点，结构严密，形态固定，构成一个球状结构区域，是一个自折叠单位，整体看来形似风筝的头和躯干。最近提出的BoPrP23
8、-230NMR结构模型与HuPrP23-230NMR结构模型高度相似，也说明了朊蛋白病的代表疯牛病从牛传染给人的可能5。PrPsc及其经过蛋白酶水解后形成的PrP2730极为难溶，以往的变换红外光谱（FTIR）和核磁共振（NMR）等方法已不可能研究及预测出其较为准确的三维模型。因此在以上研究出的PrPc的结构模型基础上，人们试将其中的部分螺旋改为折叠，进而探索其新的PrPsc结构模型。PrPCPrPSC PrPSC在N端切割可以产生PrP27-30，这种分子是一种蛋白酶抗性蛋白，能够聚集成为棒状淀粉样蛋白。二级结构出现a 螺旋 b折叠转换，PrPC的a螺旋含量达到42%， b片层仅占3%；Pr
9、PSC 的a螺旋含量降到30%， b片层达到45%；PrP27-30 a螺旋含量则仅为21%，而b片层达到54%。 具有大量的折叠的PrPsc溶解度会降低，抗蛋白酶水解能力会增强，在转变过程中，唯一的二硫键仍保持完好，主要转变部位在第90112位的氨基酸残基之间6 ，b片层含量的增加可能是聚合成淀粉样原纤维的最直接原因。Prusiner实验室的Wille最近提出了PrPsc的二维结晶结构模型。这种模型显示出跟以往不同的特点是螺旋不是转变为折叠，而是转变为螺旋，整个二维结晶结构模型呈六边形结构，N端的螺旋位于六角单元之内，与位于六角形边上的第二个螺旋和第三个螺旋及位于六角形单元之间的糖基相对称7
10、。他的这个模型是通过电镜发现的，结晶结构只能在高分辨率的条件下被发现，光谱研究条件下折叠和螺旋是不能被区分的，所以这点差异在早期的研究中没有被发现。朊病毒特殊的理化性质1. 高压蒸汽灭菌（134138）18分钟不能使其完全灭活。2. 对紫外线（波长254nm）照射的抵抗力比一般的病毒高40200倍，但是对237nm的紫外线敏感。3. 对一般的离子辐射和超声波抵抗力很强。4. 对许多微生物有致死作用的一般化学消毒剂对朊病毒却无法起到坡坏作用，如37的20%的福尔马林溶液中可存活28个月。5. 对多种核酸酶（RNA酶和DNA酶）有抵抗作用，但可以被胰蛋白酶降解。这一点也证明了朊蛋白中不含有核酸。6
11、. 一些蛋白质变性剂或氨基酸化学修饰剂对其具有灭活或抑制作用，如尿素、SDS等处理则使其失去活性。朊病毒独特的生化特性1. 不形成包涵体，不含非宿主蛋白，不诱生干扰素，对干扰素也不敏感，不干扰其他病毒诱生干扰素，也不受普通病毒干扰。2. 不破坏宿主B细胞和T细胞的免疫功能，也不引起宿主的免疫反应。3. 在电镜下见不到其病原颗粒，但可检测出痒病相关纤维（SCeapre Associate Fibrils，SAF）4. 朊蛋白病毒一旦致病，免疫增强剂和免疫抑制剂均不能改变致病过程。5. 朊蛋白病毒（PrPsc）在温和的清洁提取物中大量聚合成痒病相关纤维（SAF）或短杆结构，即在非变性去污剂中不溶，
12、而细胞朊蛋白（PrPc）则可以完全溶于其中，只以单体或是二聚体形式存在，故用核磁共振（NMR）和X光谱分析就可以检测到PrPc的三维构象，却不能辨别PrPsc的构象。6. PrPsc具有相对的抗蛋白酶水解特性，如在用蛋白酶K进行水解时，PrPsc只被水解掉其N端的67个氨基酸残基，形成PrP2730成为其致病的“先驱”。而PrPc则可被完全水解掉11，故PrPsc的半衰期特别长，而PrPc的半衰期短。7. PrPsc和PrPc都依赖于磷酸肌醇磷脂酶结合位点（GPI）附着在细胞表面，经过磷酸肌醇磷脂酶C（PUPLC）酶解后，PrPsc不能从膜上释放，而PrPc则可以。用Trion X-114进行
13、相分离后，PrPc处于水相。而PrPsc则处于Trion X-114相中。8. 用特异的抗体与朊蛋白反应，PrPsc有血清反应，而PrPc则没有反应。说明两者的高级结构是不同的8。阮病毒的致病机理阮病毒是一种只含有蛋白质而不含核酸的分子生物并且只能在寄生宿主细胞内生存。因此，合成阮病毒所需的信息有可能是存在于寄主细胞质中，而阮病毒的作用，仅在于激活在寄主细胞中为朊病毒编码的基因，使得朊病毒得以复制繁殖。另一种学说认为朊病毒的蛋白质能为自己编码遗传信息。这种假说与传统的分子生物学中的“中心法则”是相违背的，因为朊病毒没有核酸。于是人们假设朊病毒复制可能的方法，一认为是通过逆转译过程产生为朊病毒编
14、码的DNA或RNA（如为RNA则还需进行逆转录）必须存在逆转译酶，甚至还要有逆转录没。二为蛋白质指导下的蛋白质合成，即蛋白质本身可作为遗传信息。宿主细胞的朊病毒蛋白能够被转化为错误折叠且具有传染性的PrPsc形式，并最终引发朊病毒疾病。如今，英国科学家通过开发出一种新的细胞体系，从而为研究朊病毒蛋白如何被转化为错误折叠的蛋白质提供了新的视点。研究人员认为，这一发现为朊病毒疾病药物的研制铺平了道路。为了更为详细地研究朊病毒的转化，伦敦大学学院的R. Goold和同事开发的朊病毒蛋白在羧基端表达了一个MYC标签。它们被转染进入一个易感朊病毒的小鼠细胞系该细胞系内生的朊病毒蛋白已被“沉默”了。研究人
15、员发现，被MYC标记的结构在野生型水平上被表达并且正常地局部化，同时在暴露于朊病毒的情况下会完全转化为MYC标记的PrPsc。为了证实这些细胞在产生具有传染性的朊病毒，它们的提取物被用来感染小鼠，后者随后发展出了神经病理类型的朊病毒疾病。之前的研究表明，重新合成的PrPsc在暴露于传染物质72小时（或更长）后将会出现。有趣的是，研究人员发现，一些MYC细胞会在两个小时内积聚成PrPsc，并且实际上仅仅1到2分钟的暴露便足以导致转化。因此研究人员指出，转化比之前的认识快得多。 质膜暗示了朊病毒转化的位点，事实上，在细胞暴露于传染物质仅1分钟的时间里，PrPsc仅仅出现于质膜上。然而，细胞内的Pr
16、Psc在暴露2分钟后才被发现，这意味着它被迅速内吞，并输送进入细胞。实际上，PrPsc在细胞内的位置被发现依赖于暴露的时间长度，即PrPsc在最早的时间点被特有地置于质膜上，并随后分布在细胞内部。为了证明朊病毒转化能够发生在质膜上，研究人员抑制了内吞作用，这并没有防止PrPsc的形成。重要的是，在经过特定磷酸肌醇磷脂酶C或完全破坏脂筏的介质处理后，PrPsc的水平在MYC细胞中显著下降。因此，最初的朊病毒转化似乎首先发生在质膜上，或许也在脂筏中。然而，通过在PrPsc被内吞后加速转化，细胞内的分隔可能在其中扮演了一个角色9。人工重组朊蛋白的成功，一方面，使原本一直争论不休的国际学术界，在“朊病
17、毒”假说上有了理论突破。它表明了，蛋白质也能够进行信息遗传。因为朊病毒没有核酸亦没有能够自行运作的完整系统，但却能够侵入并掠夺周边细胞，将其也感染成病毒，从而进行大规模的细胞破坏。于是人们假设朊病毒可能是通过蛋白质指导下的蛋白质扩增，即蛋白质本身可作为遗传信息。另一方面，“朊病毒”假说得到论证，可能催生出生物医学研究的一个新领域蛋白质变化的诱导机制。即在论证了蛋白质本身可作为遗传信息的基础上，进一步证明并非只有朊蛋白才可能诱变成朊病毒，别的蛋白质也可能存在相似的转变，那么，在其它神经退行性疾病，如老年痴呆、帕金森病等是否存在类似机制，引起了人们的广泛关注。从现实意义来说，它有助于发展准确可靠的
18、诊断技术，全面监测、检测朊病毒病，特别是做到对疯牛病和医源性感染的早期预防。由于假说得到论证，科学家们现在正着手研制一种快速检测试剂，以便检测出进出口的牛羊畜肉上是否含有会使人传染疯牛病的“朊病毒”。另外，这一研究成果也是首次建立了实验动物模型。在小鼠身上进一步试验，以了解更多朊病毒的相关情况。根据目前报道，因鼠和人的蛋白质结构差异大，存在一定的种属屏障，人鼠不会互相传染。参考文献1. 赵克霞 朊病毒研究新进展 淮南师范学院学报 2002年第3 期第四卷（总第15期）2. 奚正德，马宝骊 毒朊，感染的一种新的生物学原理-1997年度诺贝尔生理/医学奖评析（J）.cell,1985,40(4,)
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