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1、微生物的实验室培养(二)目标导读 1.掌握配制培养基的步骤和倒平板操作的过程。2.理解并掌握利用平板划线法和稀释涂布平板法来纯化微生物的方法。重难点击 1.掌握制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的方法。2.学会用平板划线法和稀释涂布平板法纯化微生物。一 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基牛肉膏蛋白胨固体培养基是细菌培养中常用的一种培养基，大肠杆菌的纯化就是用的该培养基。1.牛肉膏蛋白胨固体培养基的成分及各成分提供的营养培养基组分提供的主要营养物质牛肉膏5.0 g蛋白胨10.0 g_和维生素NaCl 5.0 g蒸馏水定容至1 000 mL氢元素、_元素 2.实验过程(1)培养基的配制计算：根据牛肉膏蛋白胨培养基
2、_的比例，计算配制100 mL培养基时各成分的用量 称量 溶化 ：1 moL的NaOH、pH试纸，将pH调为7.4 7.6,_：趁热分装到洁净锥形瓶中加棉塞：用棉花不用脱脂棉，脱脂棉吸水,包扎：外包_纸，且挂标签(2)灭菌(3)倒平板待培养基冷却至50 左右时，在酒精灯火焰附近进行操作：在火焰旁_手拿锥形瓶，_手拔出棉塞(如图1)。使锥形瓶的瓶口迅速通过_，目的是进行_，防止瓶口微生物污染培养基(如图2)。_手将培养皿打开_，_手将培养基倒入培养皿，立刻盖上_(如图3)。等待平板_后，将平板_放置(如图4)。3.培养基的选择：培养基配制好后，要放在_中保温12 d，若_则说明制备的培养基是合格
3、的。4.平板倒置的原因：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基_，又可以防止_。归纳提炼培养基的配制原则(1)目的要明确(根据微生物的种类、培养目的等)，如生产用培养基内可加入化学成分不明确的天然物质，而分类鉴定用培养基内必须加入已知化学成分的物质。(2)营养要协调，注意各种营养物质的浓度和比例。营养物质浓度过低不能满足微生物的营养需求，过高对微生物的生长有抑制作用，另外，培养基中各营养物质浓度比直接影响微生物的生长繁殖和代谢产物的形成和积累，其中碳氮比(C/N)的影响较大。例如，在谷氨酸生产中，当培养基中的碳源与氮源的比为41时，菌体大量繁
4、殖，而产生的谷氨酸少；当碳源与氮源的比为31时，菌体繁殖受到抑制，但谷氨酸合成量大增。 (3)pH要适宜，各种微生物适宜生长的pH范围不同，细菌6.57.5、放线菌7.58.5、真菌5.06.0。活学活用 1.下列关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的叙述，错误的是( )A. 操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌B.将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯C.待培养基冷却至50 左右时进行倒平板D.待平板冷却凝固约510 min后，将平板倒过来放置2.下列叙述错误的是( )A.右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞，为避免污染需放在酒精灯火焰附近B.倒平板整个过程应在酒精灯火焰旁进行C.打开培养皿皿
5、盖，右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖D.为避免水滴滴入培养基，平板应倒过来放置二 纯化大肠杆菌纯化大肠杆菌就是为了获得大肠杆菌的纯种菌落，这需在培养时，尽量使菌落中的菌体来自于一个大肠杆菌的分裂，即这个菌落的细菌群体由_繁殖而来，这就需要接种时尽量接种单个的大肠杆菌，最常用的是_法和_法。1.平板划线法(1)原理：通过_在琼脂固体培养基表面_的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。(2)结合示意图，完成下面步骤：操作示意图操作将_放在酒精灯火焰上灼烧，直到接种环烧红在火焰旁冷却接种环，并打开盛有菌液的试管的_将试管口通过酒精灯的_将已冷却的接种环伸入菌液中，_
6、一环菌液操作示意图操作将试管口通过酒精灯的火焰，并迅速塞上棉塞_将培养皿皿盖打开_，_将沾有菌种的接种环迅速伸入_，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基灼烧接种环，冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将_的划线与_相连将平板_，放入培养箱中培养 2.稀释涂布平板法(1)原理：将菌液进行一系列的_，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到_的表面，进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得由_个细胞形成的菌落。(2)结合示意图，完成下面步骤：系列稀释操作 a.将分别取盛有9 mL水的6支试管_，并按101106的顺序编号。b.用_吸取1
7、mL培养的菌液，注入101倍稀释的试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使_。c.从101倍稀释的试管中吸取1 mL稀释液，注入102倍稀释的试管内吹吸均匀，获得_倍液。依次类推，直到完成最后一只试管的稀释。涂布平板操作操作示意图操作将涂布器浸在盛有_的烧杯中取不超过_的菌液，滴加到培养基表面将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，_用涂布器将菌液均匀地涂布在_。涂布时可转动培养皿，使_ 3.菌种的保存为了保持菌种的纯净，需对菌种进行保藏。保存时间保存方法具体方法后续处理频繁使用_法将菌种接种到试管的_培养基上，在合适的条件下培养，长成菌落后，放入_的冰箱中保藏每_个月需重新
8、接种。否则菌种容易被污染或产生变异长期保存_法在_ mL的甘油瓶中，装入_ mL甘油后灭菌。将_ mL菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混合放入_的冷冻箱中保存 将菌种放在低温环境中保藏的目的是_。归纳提炼1.平板划线法中几次灼烧接种环的目的 烧灼时期目的取菌种前杀死接种环上原有微生物每次划线前杀死上次划线后接种环上残留菌种，使下次划线的菌种直接来自于上次划线末端，使每次划线菌种数目减少，达到分离菌株的目的接种结束后杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者 2.稀释涂布平板法稀释涂布平板的操作比较复杂，且各个细节均需保证“无菌”，应特别注意：(1)酒精灯与培养皿的距离要合适。 (2)吸
9、管头不要接触任何其他物体。(3)吸管要在酒精灯火焰周围使用。活学活用 3.如图为纯化大肠杆菌的一个操作环节，下列相关叙述中，错误的是( )A.该操作步骤是接种，方法是平板划线法B.除第一次划线外，以后的每一次划线的起点是上一次划线的末端C.图中细菌密度最小的是5处 D.该接种方法适用于细菌的计数课堂小结 当堂检测1.有关稀释涂布平板法的叙述，错误的是( )A.首先将菌液进行一系列的梯度稀释B.然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面C.在适宜条件下培养 D.结果都可在培养基表面形成单个菌落2.如图是微生物平板划线示意图，划线的顺序为12345。下列操作方法正确的是( )A.只在操作
10、前将接种环放在火焰边灼烧灭菌 B.划线操作须在火焰上进行C.在5区域中才可以得到所需菌落 D.在12345区域中划线前后都要对接种环灭菌3.将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37 恒温箱的目的是( )A.对比观察培养基有没有被微生物利用 B.对比分析培养基上是否生有杂菌C.没必要放入未接种的培养基 D.为了下次接种时再使用4.获得纯净培养物的关键是( )A.将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌B.接种纯种细菌 C.适宜环境条件下培养 D.防止外来杂菌的入侵5.(1)在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑_、_和渗透压等条件。由于该细菌具有体积小、结构简单、变
11、异类型容易选择、_、_等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。(2)在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养器皿进行_(消毒、灭菌)；操作者的双手需要进行清洗和_；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能_。(3)若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的_。(4)通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的_。(5)培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是_。(6)若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其
12、培养物必须经过_处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。 答案精析一知识梳理1.碳源、磷酸盐和维生素 氮源 无机盐 氧2.(1)配方 称量纸 蛋白胨 迅速称取 琼脂 琼脂 100 调节pH 分装 牛皮 (2)高压蒸汽 干热 (3)右 左 火焰 灭菌 左 一条缝隙 右 皿盖 冷却凝固 倒过来3.恒温箱 无菌落生长4.表面的水分更好地挥发 皿盖上的水珠落入培养基，造成污染活学活用1.A 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是计算、称量、溶化、灭菌、倒平板，不能颠倒。牛肉膏容易吸潮，所以当牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻棒取出称量纸。待培养基冷却至50 ，用手触摸锥形瓶刚刚不烫手，并且培养基处于溶化状态时，
13、进行倒平板。平板冷却510 min后还需倒置。2.C二知识梳理一个大肠杆菌 平板划线 稀释涂布平板1.(1)接种环 连续划线(2)接种环 棉塞 火焰 沾取 左手 一条缝隙 右手 平板内 最后一区 第一区 倒置2.(1)梯度稀释 琼脂固体培养基 单 (2)a.灭菌 b.移液管 菌液与水充分混匀 c.102 酒精 0.1 mL 冷却810 s 培养基表面 菌液分布均匀3.临时保藏 固体斜面 4 36 甘油管藏 3 1 1 20 降低微生物的新陈代谢速率活学活用3.D 图中所示的纯化方法是平板划线法，该方法要求要连续划线多次，直到最后一次划线的末端细菌呈单个存在，所以该方法仅用于细菌的纯化，不适合用于细菌的计数。课堂小结称量 调pH当堂检测1.D 2.D 3.B 4.D5.(1)温度 酸碱度 易培养 生活周期短(2)灭菌 消毒 损伤DNA的结构(3)比例合适 (4)鉴别(或分类)(5)将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生 (6)灭菌