生化蛋白章节复习资料.doc

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1、蛋白质的结构与功能1) 蛋白质的生物学作用：功能蛋白、结构蛋白 具有以下几种主要功能：一、生物催化作用二、代谢调节作用三、免疫保护作用四、物质的转运和储存五、运动与支持作用六、生长、繁殖、遗传和变异作用七、生物膜的功能和受体八、另外，外源蛋白质有营养功能，可作为生产加工的对象2) 蛋白质的组成(元素组成、化学组成)及蛋白质含量的测定一、蛋白质的元素组成蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质 还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、碘、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分 比约为：碳 50，氢 7，氧 23，氮 16%，硫 0 3，其他 微量二、蛋白质的含量

2、测定蛋白质中的氮占生物组织中所有含氮物质的绝大部分。因此， 可以将生物组织的含氮量近似地看作蛋白质的含氮量。由于大多数蛋白质的含氮量接近于 16%，所以，可以根据生 物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量。这是凯氏( Kjadehl ) 定氮法的理论基础。蛋白质的含量 =蛋白质含氮量× 100/16=蛋白质含氮量× 6.253) 二十种氨基酸的结构、分类及名称(三字缩写符、单字缩写符)根据 R 侧链基团解离性质的不同，可将氨基酸进行分类：1. 酸性氨基酸 Glu ，Asp；侧链基团在中性溶液中解离后带负电荷的氨基酸。2. 碱性氨基酸 His， Arg ， Lys；侧链基团在

3、中性溶液中解离后带正电荷的氨基酸。3. 中性氨基酸 侧链基团在中性溶液中不发生解离， 因而不带电荷的氨基酸。 可分为：4、极性氨基酸： Ser， Tyr，Thr，Asn，Gln，Cys，Gly；5、非极性氨基酸： Phe，Pro，Trp，Ala，Val，Leu， Ile ， Met。6、人体必需氨基酸有八种：Thr Ile Trp Leu PheMetValLys苏异色亮苯蛋缬赖7、几种重要的不常见的氨基酸在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为不常见蛋白质氨基酸。 这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。 其中重要的有 4-羟基脯氨酸、 5-羟基赖氨酸、 N- 甲基赖氨酸、和 3

4、,5-二碘酪氨酸等。氨基酸的缩写符号名称三字符号单字符号名称三字符号单字符号丙氨酸AlaA亮氨酸LeuL精氨酸ArgR赖氨酸LysK天冬氨酸AspD甲硫氨酸MetM半胱氨酸CysC苯丙氨酸PheF谷氨酰胺GlnQ脯氨酸ProP谷氨酸GluE丝氨酸SerS组氨酸HisH苏氨酸ThrT异亮氨酸IleI色氨酸TrpW甘氨酸GlyG酪氨酸TyrY天冬酰胺AsnN缬氨酸ValV4) 氨基酸的重要理化性质：两性解离、茚三酮显色、与2,4-二硝基氟苯( DNFB )反应、与异硫氰酸苯酯( PITC )的反应一、氨基酸的光吸收 组成天然蛋白质分子的 20 种氨基酸中，只有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸对近紫外光有光

5、吸收。其吸收峰在 280nm 左右，以色氨酸吸收最强。 可利用此性质采用紫外分分光度法测定蛋白质的含量。、氨基酸的解离性质与等电点氨基酸在结晶形态或在水溶液中， 并不是以游离的羧基或氨基形式存在， 而是离解成两 性离子。 在两性离子中， 氨基是以质子化 (-NH3+) 形式存在， 羧基是以离解状态 (-COO-) 存在。PH 17净电荷 +10正离子两性离子侧链不含离解基团的中性氨基酸，等电点 PI10-1负离子COOH+-HCOO-+-H+H 3N C HpK1'+H 3N C HpK2'R+H3R+H在不同的 pH 条件下，两性离子的状态也随之发生变化。COOH 2 NC

6、HR其 pI 值也决定于两性离子两边的pK'值的算术平均值。pI = (pK '1 + pK '2 )/2 对于侧链含有可解离基团的氨基酸，酸性氨基酸：pI = (pK '1 + pK ' R-COO- )/2碱性氨基酸：pI = (pK '2 + pK ' R-NH2 )/2三、茚三酮反应：氨基酸与茚三酮加热反应产生蓝紫色物质，其最大吸收峰在 570nm 波长 处，因此可利用该性质进行比色可测定氨基酸的含量。脯、羟氨酸与之反应呈黄色，天冬酰 胺与之反应呈棕色。5）蛋白质的一级结构：肽、肽键、活性多肽及一级结构的测定 蛋白质的一级结构是构

7、成蛋白质的氨基酸种类、 数量和排列顺序。 一级结构中包含的共 价键指肽键（ peptide bond ）和二硫键（ disulfide bond ）。一、肽键与肽链 一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间失水形成的酰胺键称为肽键。 氨基酸通过 肽键相连的化合物称为肽。二、多肽 在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序。 通常在多肽链的一端含有一个游离的 -氨基，称为氨基端或 N- 端；在另一端含有一 -羧基，称为羧基端或 C-端。氨基酸的顺序是从 N- 端的氨基酸残基开始，以 C- 端氨基酸残基为终点的排列顺序。蛋白质是由一条或多条多肽 （polypeptide）

8、链以特殊方式结合而成的生物大分子。 蛋白质与多肽并无严格的界线， 凡氨基酸残基数目在 50 个以上， 且具有特定空间结构的 肽称蛋白质；凡氨基酸残基数目在 50 个以下，且无特定空间结构者称多肽。三、谷胱甘肽（ GSH ）谷胱甘肽是由谷氨酸 -Glu、半胱氨酸 Cys、甘氨酸 Gly 组成的，是体内重要的还原剂。 2 分子 GSH （还原型谷胱甘肽）脱 2H 生成一分子 GSSC（氧化型谷胱甘肽） 。四、催产素和升压素均为 9 肽，第 3 位和第 9 位氨基酸不同。催产素使子宫和乳腺平滑肌收缩，具有催产和 促使乳腺排乳作用。升压素促进血管平滑肌收缩，升高血压，减少排尿。 （作了解）五、蛋白质一

9、级结构的测定原理 测定蛋白质的一级结构的要求A. 样品必需纯（ >97% 以上）；B. 知道蛋白质的分子量；C. 知道蛋白质由几个亚基组成；D. 测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。E. 测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。 N 末端氨基酸的分析：二硝基氟苯（ DNFBA ）法、 Edman 降解法、氨肽酶法 C 末端氨基酸的分析：肼解法、羧肽酶法6）蛋白质的空间结构：二级结构单元（ -螺旋、 -折叠、 -转角、自由回转） 、三级与四级结构（超二级结构、结构域、亚基）及结构与功能的关系（一）维持蛋白质构象的化学键 维系蛋白质分子的一级结构：肽键、二硫键 维系蛋白质分

10、子的二级结构：氢键 维系蛋白质分子的三级结构：疏水相互作用力、氢键、范德华力、盐键 维系蛋白质分子的四级结构：范德华力、盐键（二）蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构 （secondary structure） 是指多肽链的主链骨架中若干肽单位，各自沿一定的轴盘旋或折叠，并以氢键为主要次级键而形成有规则的构象 -螺旋、 -折叠、 -转角。蛋白质的二级结构一般不涉及氨基酸残基侧链的构象。1. （peptide unit） 。O（ 1）肽键具有部分双键的性质，不能自由旋转。CC N C （ 2）肽单位是刚性平面结构。H（3）肽单位中与 CN 相连的 H 和 O原子与 碳原子呈反向分布。（4）多肽链的盘

11、旋或折叠是由肽链中许多 碳原子的旋转所决定的。2. -螺旋（ -helix ）：蛋白质分子中多个肽键平面通过氨基酸 -碳原子的旋转，使多肽链的主骨架沿中心轴盘曲成稳定的 -螺旋构象。 - 螺旋有以下特征：（1）螺旋的方向为右手螺旋，每 3.6 个氨基酸旋转一周，螺距为 0.54 nm，每个氨基酸残基 的的高度为 0.15 nm ，肽键平面与螺旋长轴平行。（2）氢键是 -螺旋稳定的主要次级键。相邻的螺旋之间形成链内氢键，即一个肽单位的N 上氢原子与第四的肽单位羧基上的氧原子生成氢键。（ 3）肽链中氨基酸残基的R 基侧链分布在螺旋的外测，其形状、大小和电荷等均影响-螺旋的形成和稳定性。3. -折叠

12、（ -pleated sheet） -折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿状折叠的构象。-折叠有以下特征：a. 肽链的伸展使肽键平面之间一般折叠成锯齿状；b. 肽链平行排列， 相邻肽链之间的肽键相互交替形成氢键， 是维持这种结构的主要次级键；c. 肽链平行的走向有顺式和反式两种；d. 肽链的氨基酸残基的 R 键分布在片层的上下。4. -转角 （ -bend）-转角是多肽链 180°回折部分所形成的一种二级结构，其结构特征为： 主链骨架本身以大约 180°回折 ; 回折部分通常由四个氨基酸残基构成 ;构象依靠第一残基的 -

13、CO 基与第四残基的 -NH 基之间形成氢键来维系。 （4）这类结构主要存在于球状蛋白分子中。5. 无规线圈 （random coil） 无规线圈是指多肽链主链部分形成的无规律的卷曲构象。 没有一定规律的松散肽链结构，但仍是紧密有序的稳定结构，通过主链间及主链与侧链 间氢键维持其构象（三）超二级结构（基序） 是指在多肽内顺序上相邻的二级结构常常在空间折叠中靠近,彼此相互作用 ,形成有规则的的二级结构聚集体。超二级结构的基本形式： ； ；。超二级结构在结构层次上高于二级结构，但没有聚集成具有功能的结构域。（四）结构域 （domain） 结构域：是位于超二级结构和三级结构间的一个层次。在较大的蛋白

14、质分子中,由于多肽链上相邻的超二级结构紧密联系,进一步折叠形成一个或多个相对独立的致密的三维实体,即结构域。有的蛋白质分子有一个结构域,有的有多个。（ 五）蛋白质的三级结构 （tertiary structure）具有二级结构、 超二级结构或结构域的一条多肽链 , 由于其序列上相隔较远的氨基酸残基侧 链的相互作用 , 而进行范围更广泛的盘曲和折叠 , 形成包括主、 侧链在内的空间排列 , 这种 在一条多肽链中所有原子或基团在三维空间的整体排布称为三级结构。蛋白质的三级结构是指多肽链中所有原子或基团的空间排列。 即多肽链在二级结构的基础上，由氨基酸侧链基团的相互作用使多肽链进一步盘旋和折叠， 导

15、致整个分子形成不规则 的特定构象。（六）蛋白质的四级结构 （Quaternary Structure） 由两个或两个以上的亚基之间相互作用，彼此以非共价键相联而形成更复杂的构象， 称为蛋白质的四级结构。亚基 （subunit） 就是指参与构成蛋白质四级结构的、每条具有三级结构的多肽链。7）蛋白质的性质：大分子性质、蛋白质分子量的测定（离心法、凝胶过滤法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法） 、两性解离（等电点、电泳、离子交换） 、胶体性质、蛋白质沉淀 （可逆沉淀、不可逆沉淀） 、蛋白质变性、紫外吸收及颜色反应一、蛋白质分子的大小、形状及分子量的测定1. 分子筛层析法2.SDS-PAGE3.生物质谱4

16、.超速离心法二、蛋白质的变性蛋白质的高分子特性形成了复杂而特定的空间构象， 从而表现出蛋白质特异的生物学功 能。某些物理的和化学的因素使蛋白质分子的空间构象发生改变或破坏， 导致其生物活性的 丧失和一些理化性质的改变，这种现象称为蛋白质的变性 （denaturation） 。1. 变性的本质 蛋白质变性作用的本质是破坏了形成与稳定蛋白质分子空间构象的次级键， 从而导致蛋 白质分子空间构象的改变或破坏，而不涉及一级结构的改变或肽键的断裂。2. 变性作用的特征 （1）生物活性的丧失 （2）某些理化性质的改变物理性质改变，如：溶解度降低，粘度升高，失去结晶能力，旋光值改变。 化学性质改变， 如： 蛋

17、白质变性时， 有些原来在分子内部包藏而不易与化学试剂起反应 的侧链活性基团， 由于结构的伸展松散而暴露， 易与化学试剂反应。 （如-SH、咪唑基、 -OH ）。生物化学性质改变：蛋白质变性后，分子结构伸展松散，易为蛋白质水解酶所分解。 生物碱试剂变性：三氯醋酸、磷钨酸、水杨酸等。在pH<pI 时，蛋白质带正电，和有机酸根离子易结合形成沉淀，导致变性。重金属盐变性： 在 pH> pI 时，蛋白质带负电， 更易与重金属离子 （ Hg2、Pb2+、Cu2+） 结合形成沉淀，导致变性。两性电三、蛋白质的两性电离与等电点阳离子兼性离子阴离子PH<PIPH=PIPH>PI在等电点时

18、 （Isoelectric point ，pI） ，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。 在不同的 pH 环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带负电 荷，在电场中向正极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带正电荷， 在电场中向负极 移动。这种现象称为蛋白质电泳 （Electrophoresis） 。四、蛋白质的胶体性质1.蛋白质表面具有水化层2. 蛋白质表面具有同性电荷五、蛋白质的沉淀反应 盐析法高盐浓度时， 因破坏蛋白质水化层并中和其电荷， 促使蛋白质颗粒相互聚集而沉淀， 这种 现象称为盐析作用。低度浓度可使蛋白质溶解度增加，称为盐溶作用 有机溶剂沉淀与水互溶的有

19、机溶剂（丙酮、 乙醇等），这些溶剂与水的亲和力大，能夺取蛋白质颗粒上 的水化膜，加之有机溶剂的介电常数低，分子间引力加大，蛋白质溶解度降低而沉淀。 加热沉淀反应 加热灭菌的原理是因加热使细菌蛋白变性凝固而失去生物活性的结果。 重金属盐沉淀蛋白质 生物碱试剂沉淀蛋白质六、蛋白质的颜色反应1. 茚三酮反应：在 pH57 时，蛋白质与茚三酮丙酮液加热可产生蓝紫色。2. 双缩脲反应：蛋白质在碱性溶液中可与Cu2+产生红色反应。3. 酚试剂反应：在碱性条件下，蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸可与酚试剂生成蓝色化合物8）蛋白质的分离与纯化的基本原理一. 蛋白质的提取二. 蛋白质的分离与纯化1. 根据溶解度不同

20、的分离纯化方法： （ 1）等电点沉淀法（ 2）盐析沉淀法（ 3）低温有机溶 剂沉淀法（ 4）温度对蛋白质溶解度的影响2. 根据分子大小不同的分离纯化方法：（1）透析和超滤法（ 2）分子筛层析原理：利用分子量的差异（ 3） 密度梯度离心3. 根据电离性质不同的分离纯化方法（1）电泳法（ 2）离子交换层析阴离子交换树脂含有碱性基团 如一 N（CH3）+3 ，OH- ，碱性基团解离出的 OH离 子可以和溶液里的阴离子 （如氨基酸阴离子 ）发生交换，然后被洗脱。氨基酸的洗脱顺序与阳 离子交换柱相反。4. 根据配基特异性的分离纯化方法三. 蛋白质的纯度测定和含量测定纯度测定： 1.层析法； 2.电泳法；

21、 3.免疫化学法 含量测定： 1.凯氏定氮法（ Kjeldahl ）； 2.福 林酚试剂（ Lowry ）法； 3.双缩脲法； 4.紫外分光光度法 5.BCA 比色法 6.Bradford 蛋白分 析法 物理分析：质谱法，磁共振法，荧光光谱法9）蛋白质的分类：按外形及组成分类A 、分子形状： 1.球状蛋白质 2.纤维状蛋白B 、化学组成： 1.单纯蛋白 （simple protein） ：其完全水解产物仅为氨基酸。 1）清蛋白和球蛋白：广泛存在于动物组织中。清蛋白易溶于 水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。 （ 2）植物谷蛋白：不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中。（ 3）精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。 （ 4）硬蛋白：存在于各种软骨、腱、 毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。2. 结合蛋白 （conjugated protein） ：由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成.：色蛋白、糖蛋白、脂蛋白、核蛋白、磷蛋白溶解度分类：可溶性蛋白：可溶与水、稀中性盐和稀酸溶液。 醇溶性蛋白：不溶与水、稀盐，而溶于70% 80%的乙醇。不溶性蛋白：不溶与水、稀中性盐、稀酸、碱和一般有机溶媒。C、功能分类：活性蛋白质与非活性蛋白质