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1、北京雷根生物技术有限公司乙醇脱氢酶(ADH)检测试剂盒(乙醛微板法)简介：乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase ，ADH)的系统名为乙醇：辅酶I氧化还原酶(alcohol : NAD+ oxidoreductase )，大量存在于人和动物肝脏、植物及微生物细胞之中，是一种含锌金属酶，具有广泛的底物特异性。乙醇脱氢酶够以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)为辅酶，催化伯醇和醛之间的可逆反应：CH3CH2OH+ NAD+宀CH3CH0 +NADH+H+。在人和哺乳动物体内，乙醇脱氢酶与乙醛脱氢酶(ALDH)构成了乙醇脱氢酶系，参乙醇脱氢酶与体内乙醇代谢，是人和动物体内重要的代谢酶。作为
2、生物体内主要短链醇代谢 的关键酶，它在很多生理过程中起着重要作用。丙酮酸脱羧酶(PDC)、乙醇脱氢酶(ADH)是乙醇发酵途径的关键酶，无氧呼吸途径代谢产物的过程积累对细胞产生毒性，影响线粒 体结构和三羧酸循环的相关酶活性。Leagene乙醇脱氢酶(ADH)检测试剂盒(乙醛微板法)检测原理是在弱碱条件下，以乙 醛为底物，乙醛在 ADH催化下被NADH还原为乙醇，ADH每催化1分子乙醛消耗1分 子NADH，通过分光光度比色法(酶标仪)测定吸光度的变化，计算出 NADH的消耗速率进 一步推算出乙醇脱氢酶活性水平。该试剂盒主要用于检测植物样本、血清等中乙醇脱氢酶 活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于
3、临床诊断或其他用途。组成:编号TE0471100TStorage试剂(A): ADH Lysis buffer250ml4 C避光试齐U (B): PMSF1ml-20 C试剂(C): ADH Assay buffer20mlRT试齐U (D): NADH1支-20 C使用说明书1份自备材料：1、研钵或匀浆器2、离心管或试管3、低温离心机4、96孔板5、酶标仪操作步骤（仅供参考）：1、配制 ADH Lysis buffer 工作液：取出 ADH Lysis buffer 和 PMSF，恢复至室温， ADHLysis buffer : PMSF按一定比例混合，混匀，即配即用，不易久置，否则蛋白酶
4、抑制剂PMSF的效率会有所下降。2、准备样品： 植物样品：取植物组织（根系）清洗干净，切碎，植物组织：ADH Lysis buffer 工作液按一定的比例，加入预冷的ADH Lysis buffer 工作液，冰浴情况下充分匀浆或研磨。离心留取上清液即为乙醇脱氢酶粗提液。短期4 C保存待用，长期-20 C冻存待用。 血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定， 冻存，用于乙醇脱氢酶的检测。 细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如有必要用ADH Lysis buffer工作液进行适当匀浆，离心，取上清液，冻存，用于乙醇脱氢酶的检测。 高活性样品：如果样品中含有
5、较高活性的乙醇脱氢酶，可以使用ADH Lysis buffer 工作液进行恰当的稀释。3、 配制NADH 工作液：取出 NADH，恢复至室温，准确溶解于ddH 2O，混匀，预冷备 用。-20 C保存1周有效。注意：该 NADH工作液为过量。4、配制ADH Assay buffer 工作液：取出 ADH Assay buffer 、NADH 工作液，恢复至室温，ADH Assay buffer : NADH 工作液按一定的比例混合，混匀，即为ADH Assaybuffer工作液。最好即配即用，4 C预冷备用，-20 C保存1周有效。5、 ADH加样：按照下表设置对照孔 （备选，一般可以不设对照孔
6、卜测定孔，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。如果样品中的乙醇脱氢酶活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置平行孔。加入物（讪）对照孔（备选）测定孔ADH Lysis buffer 工作液5一待测样品一5ADH Assay buffer 工作液2002006、ADH测定：加入 ADH启动剂，立即以酶标仪测定吸光度（记为A。）并同时计时，每隔30s测定一次吸光度，其中至 1min时吸光度记为 A1，记录其变化。Leagene建议加 入ADH启动剂后立即检测，加样时间越短越好，其反应基本在1-3min内，其后反应趋于平缓。注意：该反应系统是利用速率变化，求得相
7、应OD的变化，进而推算岀 NADH的消耗速率，再进一步推算出乙醇脱氢酶的量。因此加入ADH启动剂立即计时很重要，每次检测指标不宜过多，否则有可能由于操作时间有差异进而导致结果偏差。计算：乙醇脱氢酶活性定义：每分钟NADH氧化吸光度变化0.01为1个酶活力单位。液体样品 ADH(U/ml min)= AA/(0.01 xt >0.005)式中：AA=Ao-A1(如有必要，可再减去对照最初1min的吸光度变化量)0.01=每分钟NADH氧化吸光度变化 0.01为1个酶活力单位th=检测时间(min)0.005=待测样品体积(ml)组织样品 ADH(U/g min)= AA/(0.01 X &
8、gt;W)式中：AA=Ao-A1(如有必要，可再减去对照最初1min的吸光度变化量)0.01=每分钟NADH氧化吸光度变化 0.01为1个酶活力单位t=1=检测时间(min)W=待测样品鲜重或干重(g)组织或植物粗酶液获得率 (ml)=上清液体积(ml)/组织或植物质量 X00%注意事项：1、实验材料应尽量新鲜，如取材后不立即使用，应存于 -20-80 C。2、待测样品中不能含有磷酸酶抑制剂，同时需避免反复冻融。3、如果没有酶标仪，也可以使用普通的分光光度计测定，但应考虑分光光度计的最小检测体积。4、 该反应系统是利用速率变化，求得相应0D的变化，进而推算出 NADH的消耗速率，再进一步推算出乙醇脱氢酶的量。因此加入ADH启动剂立即计时很重要，每次检测指标不宜过多，否则有可能由于操作时间有差异进而导致结果偏差。5、 酶液的稀释度应尽量控制在A340/min 下降范围在0.1-0.2之间，以便减少实验误差。6、 AA为反应最初1min内吸光度变化的绝对量，如有必要可减去对照液最初1min的吸光度变化量。7、 所测样本的浓度过高，应用ADH Lysis buffer工作液稀释样品后重新测定。有效期：6个月有效。