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1、实验十、土壤中芽抱杆菌的分离与筛选培养基配制及样品采集一、实验目的学习和掌握菌种选育技术中从自然界中采样的技术，掌握芽抱杆菌筛选的特 异性培养基配制方法。二、实验原理自然界含菌样品极其丰富，土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果 等都含有众多微生物，种类数量十分可观。但总体来讲土壤样品的含菌量最多， 土壤由于具备了微生物所需的营养、 空气和水分，是微生物最集中的地方。从土 壤中几乎可以分离到任何所需的菌株， 空气、水中的微生物也都来源于土壤，所 以土壤样品往往是首选的采集目标。 但各种微生物由于生理特性不同，在土壤中 的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。因此，在分
2、离菌株前要根据分离筛选的目的，到相应的环境和地区去采集样品。三实验材料1. 采样器具：灭菌的牛皮纸袋、小铲刀（或不锈钢勺）、温度计、pH试纸、 记号笔等。2. 筛选培养基：肉汤琼脂培养基四、操作步骤1.采样：用取样铲，将表层 5cm左右的浮土除去，取 525cm处的土样1025g, 装入事先准备好的塑料袋内扎好， 或事先灭菌处理的牛皮纸袋、 玻璃器也内。北 方的十燥土壤，可在1030cm处取样。给牛皮纸袋编号并记录 地点、土壤质地、 植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。（注意：一般耕作土、菜园土和近郊土壤中有机质含量丰富，营养充足，且 土壤成团粒结构，通气饱
3、水性能好，因而，微生物生长旺盛，数量多，尤其适合 于细菌、放线菌生长。山坡上的森林土，植被厚，枯枝落叶多，有机质丰富，且 阴暗潮湿，适合霉菌、酵母菌生长繁殖，微生物数量相应也比较少。从土层的纵剖面看，15cm的表层土由于阳光照射，蒸发量大，水分少，且有紫外线的杀菌作用，因而微生物数量比 525cm 土层少；25cm以下土层则 因土质紧密，空气量不足，养分与水分缺乏，含菌量也逐步减少。因此，采土样 最好的土层是525cm。一般每克土中含菌数约几十万到几十亿个，并且各种类 型的细菌和放线菌几乎都能分离到。如好气芽抱杆菌、假单胞菌、短杆菌、大肠 杆菌、某些嫌气菌等。但总的说来酵母菌分布土层最浅，约5
4、10cm,霉菌和好氧芽抱杆菌也分布在浅土层。）2. 筛选培养基配制：筛选培养基配方（g/L）:牛肉膏3,蛋白月东10,氯化钠5,琼脂粉15, pH 7.5。每500ml三角瓶装200ml培养基，121 C灭菌20min,备用。3. 无菌水制备250ml三角瓶，加入50 ml蒸僻水，玻璃珠8颗，透气塞及牛皮纸（或报纸） 封口，灭菌后备用。试管10支，装9ml/支蒸僻水，透气塞及牛皮纸（或报纸）封口，灭菌后备 用。培养皿包封，灭菌后备用。1ml吸管若十，棉花封口，报纸包扎后灭菌，备用。涂布棒包扎后灭菌，备用。五、思考题1 .你认为自然界中哪些地点更容易采集和分离到本试验的目标菌株？实验十一、土壤中
5、芽抱杆菌的分离与筛选样品处理及初筛一、实验目的学习从自然界中采集的样品中进行菌种分离的技术，掌握稀释涂布平板方法 进行芽抱菌初筛的技术。二、实验原理菌株分离（separation ）就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对他们进行 分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。菌株分离、筛选( screening )虽为 两个环节，但却不能绝然分开，因为分离中的一些措施本身就具有筛选作用。 工 业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分： 一是从自然界分离所需要的菌株,二 是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。枯草芽抱杆菌在自然
6、界中分布很广，在很多的环境中经常能够找到。由于其 体内能够产生芽抱，能抗高热，所以，获得样品时可先加热，将其他非耐热的微 生物杀死得以富集。三、实验材料1. 培养基：牛肉膏蛋白月东培养基。2. 试剂：芽抱染色液。3. 其他器具：超净工作台、显微镜、培养血、水浴锅；涂布棒、三角瓶、接 种环、洒精灯等。四、操作步骤1 .样品稀释：称取土样10g,加入到备好的玻璃珠和无菌水(90ml)的三角瓶内，振摇5 min。 按微生物稀释法操作，稀释到稀释到 103105稀释度。2. 加热处理：取最后三支土样稀释液，置于100C水浴中35分钟后，灭活营养细胞， 保留芽抱。3. 涂布平板和培养：培养基倒平板，凝固后，处理好的三个稀释度的样品各取0.1ml涂布平板，30 C倒置培养24h以上。4. 形态观察进行单染色或者芽抱染色方法，观察你分理出的细菌的芽抱产生情况。五、思考题1.你认为还有哪些方法对样品进行预先处理，有益于本试验目标菌株的获得？3