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1、果蝇总RNAF日总蛋白的提取与电泳条带分析摘 要：本实验第一部分用果蝇成体为材料，以 Trizol为提取液提取total RNA ,进行反转 录制备cDNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测 total RNA和cDNA浓度，并结合电泳图谱对 total RNA和cDNA图样进行分析；第二部分以果蝇幼体为材料，提取总蛋白，通过 SDS-PAGE 检测果蝇总蛋白表达，对表达结果进行简要分析，并比较了成体和幼体果蝇的蛋白表达差异。关键词：果蝇；total RNA ;总蛋白；反转录； RT-PCR1前言果蝇是一种非常重要的模式生物，通常所指的是黑腹果蝇，学名：Drosophila melanogaster;在
2、分类学上所届动物界，节肢动物门，昆虫纲，双翅目，果蝇科， 果蝇届。果蝇以其繁殖迅速、生长周期短、易于养殖、相对性状丰富、基因组较 为简单等显著特点成为了遗传学、分子生物学、发育生物学等重要学科的主要实 验动物之一，对果蝇基因组的测序分析也较为透彻，因此，本实验选用果蝇为实验材料，可以使数据更加具有代表性和说服力。1953年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学 诞生的里程碑开创了分子遗传学基本理论建立和发展的黄金时代1,之后的二十年中，一系列的科学发现补充了中心法则的各个环节，由此进入现代分子生物学 发展阶段，基因工程技术也应运而生。基因工程是利用重组技术，在体外
3、通过人 工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合， 然后导入微生物或真核细胞内进行无性繁殖，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新的生物类型。本实验的方法及步骤若应 用到基因工程中则可划分到目的基因的获取这一环节。即根据中心法则，DNA上的遗传信息经转录传递到 mRNA,而mRNA含量较少，可通过提取总 RNA 的方法获得mRNA ,再经特定引物的反转录获得 cDNA ,进而得到目的基因从而 应用到分子及发育生物学研究中去。同时，对RNA和总蛋白的电泳分析也是在转录水平和翻译水平研究基因表达的重要方法，即在基因工程运用中可用于检测 目的
4、基因是否导入受体细胞及是否能够顺利表达，常用的方法有 Northern blot、 RNA 原位杂交、Western blot等。2材料与方法2.1实验材料黑腹果蝇成虫2-3d龄，约6只，雌雄均等2.2试剂及仪器(1) 试剂：Trizol裂解液(50mg/ml),氯仿，异丙醇,75%乙醇，RNase free H2O，琼脂糖,TAE 电泳缓冲液,DNA marker, dd H2O, 10>PCR Buffer (含 Mg2+), dNTP (10 mM each)，引物：rp49F、rp49R; CG8189F、CG8189R, Taq DNA polymerase (2U/ pl),
5、 TBS 缓冲液(20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH7.9), 蛋白上样缓冲液，染色液，脱色液2。(2) 器材：1.5ml离心管，匀浆棒，高速台式离心机，200山及1ml微量移 液器及吸头，天平，量筒，锥形瓶，微波炉，制胶板，电泳槽，电泳仪，凝胶成 像仪，PCR仪，水平摇床等。2.3实验方法2.3.1果蝇total RNA的提取、反转录及 RT-PCR取果蝇成体于1.5ml离心管中，加1ml Trizol (50mg/ml)裂解液后，用匀浆 棒匀浆，室温放置5min，使其充分裂解，之后，在4C条件下12000g离心5min。 转移上活至一新离心管中，加入氯仿(200
6、山氯仿/ml Trizol ),振荡混匀，室温放 置2min。在4C条件下，12000g离心15min。取出离心管，小心转移上层水相 至新离心管中。加入异丙醇(0.5ml异丙醇/ml Trizol ),充分缓慢混匀，室温放置 5min。在4C条件下12000g,离心10min。取出离心管，弃上活，加入 1ml 75% 乙醇，悬起管底沉淀，继续在 4C条件下，7500g离心5min。取出离心管，弃上 活，室温十燥RNA沉淀。加入50pl RNase free H2O溶解，备用。以RNA为棋板，利用Promega公司提供反转录试剂盒合成了第一链 cDNA； (1)取一只DEPC处理过的小EP离心管
7、，向其中加入以下混合液，其体 系如下：Total RNARNase-free H2OOligo-anchor R1 h(2) 将混合液充分混匀并瞬时离心，置丁 70对孵育10 min后，立马在冰 上冷却2 min,再次瞬时离心使得混合液集丁管底；(3) 冰上继续向管中加入：5 Reaction Buffer5Ribonuclease inhibitor (20 U/ 心1.25 l 小dNTP Mix (10mM)1.25 lM-MLV Reverse Transcriptase1 plRNase-free H2O10.5 h(4) 将总反应液轻轻混匀瞬时离心，42C孵育60 min;(5)
8、最终转录产物用ddH2。水稀释适当倍数后作为PCR模板使用。在PCR管中加入如下反应体系：dd H2O19.5 k10冷CR Buffer (含 Mg2+)2.5 山dNTP (10 mM each)0.5 hDNA template (cDNA , 1： 10)1.0 hTaq DNA polymerase (2U/)0.5 h上下游引物各0.5 lPCR程序设定为：94C 2 min变性94C 15 s退火55C 15 s延伸72 C 30 s72 C 5 min进行30个循环通过10%琼脂糖凝胶电泳检测cDNA浓度2。2.3.2果蝇幼虫总蛋白的提取与SDS-PAGE检测取果蝇幼虫约5只，
9、加入200 pl TBS缓冲液在匀浆器中匀浆，将匀浆液丁 4 摄氏度条件下1000rpm离心十分钟，取出离心管，吸取上活液16山 加入4山蛋白上样缓冲液，沸水浴5分钟。通过SDS-PAGE法检测提取的总蛋白23实验结果3.1果蝇总RNA检测由图所示，箭头所指泳道为本组提取的总 RNA,发现rRNA 28S带非常弱, 而18S带则较亮且宽。3.2 cDNA RT-PCR 结果检测本实验室成员均未扩增出相应基因3.3果蝇幼虫总蛋白SDS-PAGE检测123456图中所示3号泳道为本组提取，其中6号泳道的组提取的也是幼虫总蛋白， 最明显的差异是中间偏上有两条带只在幼虫蛋白中存在，在下方，有一条带尽在
10、 成体蛋白中出现4讨论4.1结果分析真核生物中含有5S、5.8S、18S、28S沉降系数的RNA ,所以理论上应出现 三条电泳条带，而不同的试剂盒有差异，只有18S和28S两条带也是正常的。这两条带分别代表28S和18S rRNA，且第一条带（28S）亮度应为第二条（18S） 亮度的约2倍。从本实验室的电泳结果上看，28S RNA均出现较为严重的降解， 推测原因可能是提取过程中，样品在空气中暴露过久，导致一些RNA酶进入离心管中，同时，经查阅资料发现，果蝇的核糖体RNA在其28S业基的分子中部有一剪切位点，使得28S被切割产生28Sa和28S0 rRNA§其分子量大小与18S 业基的
11、大小相仿，但是未有详细论述有关果蝇RNA电泳的问题，也未有相关的照片资料，由此推测18S位置可能会呈现出一条很粗很亮的带， 这种推测和我们 的实验结果一致3。对丁 RT-PCR的结果我们推测与Taq酶的活性有关，进而乂做了补充实验，更换了 Taq酶，结果如下图:7 / 7可见更换新酶之后相比其他组出现了明显的条带，因此与我们的推测相符。虽然Taq酶届丁热稳定DNA聚合酶，但是仍有其他因素使酶失活，因此在 PCR 过程中除了要注意无污染之外，还要注意酶的活性。另外RT-PCR条带可能出现 其他情况，如条带弥散、非特异性扩增此时可采取的办法是提高退火温度，热启动或加DMSO,更换模板，更换引物。降
12、低退火温度，更换模板，重新设计引 物也是解决无条带的常用办法。从蛋白SDS-PAGE电泳图谱中可以看到，果蝇总蛋白几乎都有显现，条带 的深浅代表了此蛋白在果蝇体内的表达量，本组成员得出的定性的结果是：（1）图谱中并没有显示出所有的蛋白质， 原因是表达量过小，本实验的灵敏度无法区 分，可采用更精密的实验设计比如双向电泳等；（2）成体与幼体的蛋白表达是有 较为显著的差异的，表现在有些蛋白质仅在成体中表达， 有些蛋白则随着个体成 熟逐渐不表达，推测与行使特定的功能，以适应成体和幼体不同的生活环境； 若 想继续研究这些蛋白究竟组成结构如何可用质谱法进行元素化合物分析，得出蛋白质的组成和结构4。4.2经
13、验与体会通过一系列的实验过程，本组成员首先从理论上更加深了对基因蛋白检测原 理的认识，知识体系更为系统。更重要的是，在实验方面，亲自参与RNA和总蛋白提取，PCR等实验操作，在实验技能方面都有相应的提高；从实验内容上 看，连续的实验设计基本是一个较为完整的科研操作流程，因此，本组成员经过这次训练，科研能力也有提升。从结果上看，RNA及总蛋白的提取基本能够反应果蝇的遗传表达特征，希望能够对今后的实验提供借鉴与帮助。参考文献：1 郝军山.分子生物学的生物化学渊源J.科学技术与辩证法,1990(01).2 奥斯伯(美).精编分子生物学实验指南M.5版，科学出版社,1998.5.3 刘红;任笑蒙；李君；陈兰英.果蝇组织总RNA 的电泳谱型鉴定J.医学研究通 讯,2004,33(4):48-49.4 翁瑜,曾群力，姜槐，许正平.双向凝胶电泳比较三种常用蛋白质提取方法J.中国生物化学与分子生物学报，2005,21(5):691694.