蛋白质纯化实验参考手册.doc

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1、蛋白质纯化实验室实验手册1 / 26第一章 外源基因在大肠杆菌中的表达一、通过聚合酶链式反应（PCR）将靶基因亚克隆到质粒载体上（一）PCR引物设计的基本原则与PCR反应组分和条件1. PCR引物设计的基本原则（1）引物与靶基因间配对的碱基一般为15-20。（2）引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物G + C含量宜在45-55%左右。（3）引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在3末端不应有互补链存在。（4）引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。可用计算机进行辅助检索分析。（5）引物3末端一般以单个C或G结尾。2. PCR反应组分和条件PCR反应体系一般选用50 l体

2、积，其中含有：10×Reaction buffer，5 l2个引物，各12.5-25 pmol (终浓度各0.25-0.50 mol/L)4种底物（dATP + dCTP + dGTP + dTTP），各200mol/L模板DNA，100 ng左右Taq DNA聚合酶，2.5-3 UPCR反应条件一般为：（1）94，5分钟（2）94变性30-60秒（3）50-55退火30-60秒（4）70-72延伸30-60秒（5）725-10分钟共进行25-35次循环。循环是步骤（2）和（4）(二) 质粒DNA的小量制备1、传统方法（1）用灭菌牙签挑单菌落于3 ml LB培养液中，37培养过夜。（

3、2）在每个EP管中倒入1 ml 左右的过夜培养物，6,000 rpm 离心1分钟以收集菌体。（3）将菌体重悬于100 l 4预冷的溶液I中，并加入200 l新配制的溶液II, 盖紧管口，快速颠倒离心管6-7次，然后，冰浴5分钟。（4）加150 l 4预冷的溶液III, 倒置5-6次以混合内容物，然后，冰浴5分钟。（5）12,000 rpm 离心10分钟后，小心吸取上清至另一EP管中。（6）加2倍体积的无水乙醇，振荡混合，并在室温放置5分钟。（7）12,000 rpm离心5分钟后，移去上清，并用70%乙醇漂洗DNA沉淀。DNA沉淀自然干燥，并溶于20 l 双蒸水或1×TE缓冲液 (10

4、 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0) 中。2. Promega公司Wizard Plus小量DNA纯化方法-离心方案（适用于产品A1330，A1340，A1460及A1470）（1）12,000 rpm离心1分钟，以沉淀1-10 ml过夜培养物。（2）用250l Cell Resuspension Solution充分悬浮大肠杆菌细胞。（3）加250l Cell Lysis Solution，倒置5-6次混合。（4）加10l Alkaline Protease Solution，倒置5-6次混合，室温放置5分钟。（5）加350l Neutralization

5、 Solution，倒置5-6次混合。（6）室温，最高转速离心10分钟，回收上清。（7）将离心柱插入收集管中。（8）将上清倒入离心柱中。（9）室温，最高转速离心1分钟，倒掉流穿液，将离心柱重新插入收集管中。（10）加750l Wash Solution（加乙醇），最高转速离心1分钟，倒掉流穿液，将离心柱重新插入收集管中。（11）重复步骤（10）（用250l Wash Solution）。（12）室温，最高转速离心2分钟。（13）将离心柱插入一个无菌的1.5 ml微量离心管中。（14）在离心柱中加50-100l Nuclease-Free Water，室温，最高转速离心1分钟。（15）DNA溶液

6、保存在-20备用。 (三) 质粒DNA的中量制备1. 在100 ml 含100 g/ml 氨苄青霉素的LB培养液中加入1 ml pET-15b/Novablue甘油菌，37培养过夜；2. 4, 4,000 rpm离心10分钟以收集菌体；在菌体用3 ml 溶液 I (50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris, pH 8.0, 10 mmol/L EDTA, pH 8.0) 充分悬浮后，加入6 ml 溶液II (0.2 mol/L NaOH, 1% SDS)，并倒置混合，冰浴5-10分钟；3. 加入4.5 ml 溶液III（60ml 5 mol/L 乙酸钾，11.5 ml 冰乙酸和

7、28.5ml水），轻摇混合，冰浴10分钟；4. 4，12,000 rpm 离心20分钟，小心吸取上清至另一个50 ml离心管中；加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10分钟；5. 室温，10,000 rpm离心10分钟以沉淀DNA；6. 在沉淀用70%乙醇漂洗，自然干燥，并溶于0.3 ml 的TE (10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0) 缓冲液中，然后转入EP管中；7. 加入等体积的5 mol/L LiCl, 室温，10,000 rpm离心10分钟以沉淀大分子RNA分子；8. 回收上清，加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，12,000 rpm 离心

8、5分钟以沉淀DNA；9. DNA沉淀用70%乙醇漂洗，然后，自然干燥；10. DNA沉淀溶于200 l含50-100 g/ml 胰RNA酶的TE缓冲液中，在37保温30分钟；11. 加入等体积的13% PEG8000/1.6 mol/L NaCl, 室温放置5分钟；12,000 rpm 离心10分钟以沉淀DNA；12. 小心移去上清，DNA沉淀溶于200 l TE (pH 8.0) 缓冲液中，并用酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）抽提一次；小心将上层溶液转移到一个干净的EP管中，并加入0.1体积的3mol/L NaAc (pH 5.2)和2倍无水乙醇，混匀，-40放置30分钟；13. 12,0

9、00 rpm 离心5分钟以沉淀DNA；DNA沉淀用70%的乙醇漂洗，自然干燥，并溶于100 l TE 缓冲液中。最后，用1%的琼脂糖凝胶电泳对DNA进行定量和纯度鉴定。（四）DNA（PCR产物或质粒）的酶切 1. 一般在15-20 l体积中酶切0.2-1 g的DNA，可根据实际情况，按比例放大酶切反应的体积和DNA的量。 2. 一般用7-8 u的限制性内切酶酶切1 g的DNA，酶:DNA的比率应小于25u/g，以防止star activity。 3. 限制性内切酶一般保存在50%的甘油中，而大于5%的甘油可能会引起star activity或抑制酶切反应。因此，在酶切反应体系中，甘油的浓度一般

10、应小于5%，也就是说，限制性内切酶的体积应小于酶切反应总体积的1/10。 4. 对于双酶切反应，可考虑在同一种缓冲液中进行，一般要求任一一种限制性内切酶的活性不低于其最大活性的50%。 5. 酶切反应的时间一般为2-3小时。如果酶切不完全，可适当延长酶切反应的时间。（五）从琼脂糖凝胶或PCR反应物中回收DNA （用Promega公司的Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System适用于产品A9280、A9281及A9282）1. 从琼脂糖凝胶中切下含DNA的胶条，并放入一洁净的EP管中。按每10 mg胶条加10 l的Membrane Binding Solution

11、，漩涡震荡，并在50-60保温直到胶条完全溶解；对于PCR反应物，可直接加等体积的Membrane Binding Solution混合。2. 将SV 微柱插入收集管中，并将上述溶液加入SV微柱，室温放置1分钟。 3. 10,000 g离心1分钟，丢弃流穿液，重新将微柱插入收集管中。 4. 加700 l Membrane Wash Soluton，10,000 g离心1分钟，丢弃流穿液，重新将微柱插入收集管中。5. 用500 l Membrane Wash Solution 重复步骤4，10,000 g离心5分钟。6. 小心将微柱插入一洁净的EP管中。7. 在微柱中加50 l Nuclease

12、-Free Water，室温放置1分钟，10,000 g离心1分钟。8. 丢弃微柱，将DNA储存在4或-20。（六）PCR产物或DNA酶切片断与质粒载体的连接1. 常规方法一般在10l反应体系中，加酶切并回收的质粒载体50-100 g左右及1 l的T4 DNA连接酶（3-5 u/l），按PCR产物或DNA酶切片断摩尔数与载体摩尔数比约为3:1的比例进行连接。连接反应在13-16保温过夜。2. 快速连接方法可以通过连接Kit进行。例如，对于Takara公司的连接Kit，可在载体与插入片段的混合液（5 l）中加入5 l Kit溶液，16 保温2小时即可。（七）大肠杆菌感受态细胞的制备1. 单菌落接

13、种于3 ml LB培养液中，37过夜培养。2. 取2 ml 过夜培养物接种于200 ml LB培养液中，并且，当37培养至OD600为0.4左右时，转移至250 ml离心管中，立即冰浴30分钟。3. 在4，3,600 rpm离心10分钟，弃上清，加4预冷的0.1 mol/L CaCl2溶液10 ml, 轻摇以充分悬浮细胞。4. 转移至 50 ml 离心管中，在4，3,500 rpm离心7分钟，小心弃上清。5. 加5 ml 预冷的0.1 mol/L CaCl2 ，轻摇离心管以充分悬浮细胞；冰浴2小时后，加4预冷的80%甘油至终浓度为15%，混匀分装，并保存于-70。（八）用质粒或连接产物转化大肠

14、杆菌感受态细胞1. 常规方法一般用2-3 l连接反应物与200 l 大肠杆菌菌株感受态细胞混合，冰浴30分钟；42热激90秒，冰浴2分钟；加0.5-0.8 ml 的LB培养液，37，150-200 rpm振荡培养60分钟；低速离心以沉淀细胞，并移去大部分上清；用移液器吹吸混匀细胞，在9 cm 直径的平板涂布100-200 l 细胞悬液，并在37保温过夜。2. 快速转化方法用2-3 l连接反应物与200 l 大肠杆菌菌株感受态细胞混合，冰浴10分钟，42热激90秒，冰浴2分钟，然后涂布在含有适宜抗生素的平板上。（九）转化子的筛选和鉴定1. 通过Promega公司pGEM-T Vector Sys

15、tem的蓝/白斑筛选（1）在含有适当抗生素90 mm LB琼脂平板中央滴加40 l 2% X-gal（用二甲基甲酰胺配制）和7 l 20% IPTG.。如用150 mm平板，则加100 l 2% X-gal 和 20 l 20% IPTG。（2）用涂布棒使溶液均匀地分散在整个平板的表面。然后，在37保温1小时，使全部液体消失。（3）将pGEM-T Vector-插入片断连接反应物转化的大肠杆菌细胞涂布在上述平板的表面，37保温过夜。其中，白色菌落表明：细胞中的质粒含有插入片断；蓝色菌落表明：细胞中的质粒不含有插入片断。2. 转化子质粒DNA的酶切鉴定用灭菌牙签挑单菌落于3 ml含有适宜抗生素的

16、LB培养液中，37振荡过夜培养。吸取1 ml过夜培养物进行质粒DNA的小量抽提，用限制性内切酶酶切检验质粒DNA中是否有插入片断。3. 以菌落为模板的PCR鉴定用灭菌吸头挑取少许单菌落细胞，点在PCR管的底部。然后，加入其他PCR组分，进行正常的PCR反应（其中，PCR循环前的反应参数为：95保温10分钟），以检测菌落细胞质粒DNA中是否有插入片断。二、Stratagene公司的QuikChangeTM 定点突变方法为了保证高的突变效率，DNA模板的用量要小，DNA聚合酶的保真度要高，PCR的循环数要少。（一） 突变引物的设计 1. 对于每一个突变，需合成两条互补的引物，并且引物应通过PAGE

17、纯化。2. 引物的长度为25-45个碱基，其Tm值应大于或等于78。Tm = 81.5 + 0.41 (%GC) 675/N % mismatch, N为引物的长度。3. 突变碱基应当位于引物的中间。4. 引物的GC含量应大于或等于40%，并且应当以一个或多个C或G结尾。（二） PCR相关参数1. 小抽或中抽的质粒DNA均可用作DNA模板。 对于50l反应体系，DNA模板的用量为10-100 ng，最适用量应通过实验来确定。2. 引物应过量，一般可配成100 ng/l，用量为3-5 l。3. PCR反应条件为：95，1分钟；50-55, 1-2分钟； 68, 2 minutes/kb of p

18、lasmid length。4. 对于单个碱基的改变，退火温度为55，循环数为12次；对于两个或三个碱基的改变，或者单个氨基酸的缺失或插入，退火温度为50或55，循环数为16次；对于多个氨基酸的缺失或插入，退火温度为50或55，循环数为18次。（三）DNA模板的去除PCR反应后，取10 l反应物走1%琼脂糖凝胶电泳，以检测目标产物的量和纯度。如果目标产物的量和纯度符合要求，则在剩余反应物中加1 l限制性内切酶DpnI (10-20 u/l), 37保温2-3小时以酶解模板DNA。（四）转化取3 l DpnI酶切反应物转化200 l大肠杆菌感受态细胞。（五） 突变基因的鉴定突变基因通过DNA测序

19、鉴定。三、检测外源蛋白质在大肠杆菌中的表达如果靶基因亚克隆在含有T7启动子的表达载体（如质粒载体pET-22b和pET-15b等）上，那么重组质粒应转化入DE3溶源菌菌株 如BL21(DE3)、JM109(DE3)及Qrigami B(DE3)等 中，以进行靶基因的表达。（一） 溶菌酶-DNase I-反复冻融裂解菌体法1. 单菌落接入4ml LB培养液中，过夜培养。再以1:20转接至2管4 ml LB培养液中，当OD600为0.6-0.8时，一管加IPTG诱导，另一管不加IPTG作对照。2. 离心收集菌体，每管加Binding buffer 100 l，DNase I (2,000 u/ml

20、) 10 l，溶菌酶 (2 mg/ml) 5 l。菌体充分悬浮后，在-20放置20分钟，室温融化，如此反复冻融8-10次。3. 吸取20 l加入一洁净的EP管中，12,000 rpm离心10分钟，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，以判断靶蛋白质主要以溶解形式还是以包涵体形式存在。（二） 超声波裂解菌体法1. 单菌落接入4 ml LB培养液中，过夜培养。其中2 ml过夜培养物用于菌种保存和DNA测序，另外2 ml过夜培养物接入100 ml LB培养液中扩大培养。当OD600为0.6-0.8时，加IPTG诱导表达3-4小时。2. 4，5,000 rpm离心10分钟收集菌体，用5 ml Bin

21、ding buffer充分悬浮细胞，超声波破碎细胞（功率：120 W左右，间歇时间：10 秒，工作时间：3秒，破碎次数：40-50次）。3. 吸取20 l加入一洁净的EP管中，12,000 rpm离心10分钟，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，以判断靶蛋白质主要以溶解形式还是以包涵体形式存在。（三） SDS-煮沸裂解菌体法1. 单菌落接入4ml LB培养液中，37培养。当OD600为0.6-0.8时（约需3-4小时），吸取2 ml加入另一空的培养管中。其中，一管加IPTG诱导，另一管不加IPTG作为对照。2. 吸取1 ml培养物加入洁净的EP管中，10,000 rpm离心1分钟收集菌体。

22、在菌体管中加20 l水和20 l 2×loading buffer，沸水浴中维持3-5分钟。3. 用SDS-PAGE电泳分析上述样品，以判断靶蛋白质在大肠杆菌中的表达量。四、用大肠杆菌生产13C-15N标记的蛋白质1. 用于生产13C-15N标记蛋白质的组合培养基（每升） K2HPO4·3H2O：10.375克KH2PO4：4.375克15NH4Cl：0.5克MgSO4·7H2O：50 毫克NH4FeSO4·6H2O：7毫克盐酸硫胺：10毫克（母液浓度为10毫克/毫升）13C-葡萄糖：2.5克氨苄青霉素：100毫克（母液浓度为100毫克/毫升）除15NH

23、4Cl、13C-葡萄糖及氨苄青霉素外，其余试剂均为国产分析纯试剂；2.5克葡萄糖溶于25毫升蒸馏水中，并单独灭菌；对盐酸硫胺和氨苄青霉素采用过滤除菌；葡萄糖、盐酸硫胺及氨苄青霉素在培养前加入。2. 在大肠杆菌细胞中合成13C-15N标记的蛋白质将来自LB平板上的单菌落（含有重组质粒）接入2-3毫升组合培养基中，37振荡培养12小时（例如，从9:00-21:00），然后接入100毫升组合培养基中；过夜培养后，分别接入三个330毫升（在1升三角瓶中）组合培养基中；当37培养至OD600=0.6-0.7时，加IPTG至终浓度为1 mmol/L，并继续培养4小时，以诱导13C-15N标记蛋白质的合成。

24、第二章 蛋白质的纯化和鉴定一、 用Ni2+亲和层析柱纯化可溶性蛋白质1. 30 ml的过夜培养物加入300 ml（在1升三角瓶中） 含有100 g/ml氨苄青霉素的LB培养液中，在37 振荡培养。2. 当OD600达到0.6-1.0时，加IPTG至终浓度为1 mmol/L 进行诱导表达，培养物继续保温4小时以进行目标蛋白质的累积。3. 4 ，5,000 rpm离心10分钟收集菌体。对于500 ml菌液中的菌体，用20-30ml的start buffer充分悬浮。4. 在冰浴条件下，用超声波破碎细胞（条件为：工作时间3秒，间歇时间10秒，总次数120-200）。5. 4 ，12,000 rpm离

25、心20分钟以去除细胞碎片，上清与Ni2+亲和层析柱混合。6. 上样后，分别用start buffer (20 mmol/L Tris, pH 7.8, 0.5 mol/L NaCl) 和wash buffer （20 mmol/L Tris, pH 7.8, 0.5 mol/L NaCl, 50-100 mmol/L 咪唑）洗脱杂蛋白质，用elution buffer（20 mmol/L Tris, pH 7.8, 0.5 mol/L NaCl, 0.5 mol/L咪唑）洗脱目标蛋白质。二、 通过Ni2+亲和层析柱纯化包涵体蛋白质1. 5,000 rpm离心15 min。弃培养基，按每500

26、ml菌体加入20 ml缓冲液A。2. 震荡混匀，加入200ml 100 mmol/L PMSF。超声破碎200次（功率为200 W，工作时间为3 s，间隙时间为10 s）。12,000 rpm离心20 min。3. 弃上清，沉淀再加入5 ml缓冲液A洗涤1次。12000rpm离心20min。加入6ml盐酸胍溶液，4静置过夜。12000rpm离心20min。按以下步骤处理：（1） 用缓冲液B平衡Ni agarose柱。（2） 将盐酸胍处理的蛋白质溶液上Ni agarose柱。（3） 用约10倍床体积的含25 mmol/L咪唑的缓冲液C洗脱。（4） 用约10倍床体积的含40 mmol/L咪唑的缓冲

27、液C洗脱。（5） 用约 5倍床体积的含400 mmol/L咪唑的缓冲液C解析下目标蛋白质。缓冲液A： Tris·Cl (pH8.0) 50 mmol/ LEDTA 0.5 mmol/ LNaCl 0.4 mmol/ LMgCl 5 mmol/ L甘油 5%盐酸胍溶液：盐酸胍 6 mol/ LTris·Cl (pH8.0) 50 mmol/ L甘油 5%缓冲液B：Tris·Cl (pH 7.9) 10 mmol/ L甘油 10%NaCl 0.5 mmol/ L缓冲液C：Tris·Cl (pH 7.9) 20 mmol/ L甘油 20%KCl 100 mmo

28、l/ L三、 透析袋与超滤膜的使用注意事项可用脱盐层析柱、透析袋或超滤膜对蛋白质溶液进行脱盐、缓冲液置换或浓缩。对于透析脱盐，宜采用逐渐降低盐浓度的方式进行。（一） 透析袋使用注意事项 1. 应带上一次性薄膜手套操作透析袋。2. 透析袋一般剪成10-20 cm的小段。3. 新透析袋应在2%（w/v）碳酸氢钠和1 mmol/L (pH8.0) EDTA中煮沸10分钟，然后用蒸馏水清洗干净，再用1 mmol/L (pH8.0) EDTA中煮沸10分钟。冷却后，4保存于20%的乙醇中。4. 用过的透析袋需用蒸馏水彻底清洗干净，然后浸于20%的乙醇中，在4保存备用。（二） 超滤膜使用注意事项 1. 不

29、要用手直接拿超滤膜，应用平头镊子小心夹取超滤膜的边缘。2. 在 4，10%-20%的乙醇中保存，不要冰冻。3. 使用过的超滤膜应进行再生处理（放在培养皿中，在脱色摇床上进行），具体方案如下:(1) 蒸馏水漂洗2分钟。(2) 用0.1 mol/L NaOH漂洗10分钟。(3) 用蒸馏水漂洗以除去NaOH。(4) 70%乙醇浸泡5分钟。(5) 用蒸馏水漂洗2分钟，再保存于10%-20%的乙醇中。4. 光面向上。5. 应避免超滤pH小于3.0或pH大于13的溶液。6. 不能与下列溶液混用：（1） 胺（2） 大于10%的磷酸溶液。（3） 大于0.5%的酚溶液。（4） 大于0.01 mol/L的盐酸。四

30、、蛋白质浓度的测定 蛋白质的浓度用BCA Protein Assay Kit (pierce 公司) 测定，以牛血清白蛋白为标准。具体方案如下：1. 用Kit中的牛血清白蛋白标样配制成下列不同浓度的标准溶液：2,000 g/ml, 1,500 g/ml、1,000 g/ml、750 g/ml、500 g/ml、250 g/ml、125 g/ml及 25 g/ml（0 g/ml=空白溶液）。在这里，配标准溶液所用的稀释剂应与待测样品的相同。 2. 将50体积的BCA试剂A与1体积的试剂B充分混合，从而配成工作溶液。工作溶液最好在测定的当天配制。3. 分别将0.15 ml标准溶液、待测样品及空白溶

31、液与3 ml工作溶液在5 ml离心管中混合，37保温30分钟。然后，迅速用冰浴冷却所有的管。4. 用蒸馏水调零，在562 nm处测定样品的光密度值（最好在10分钟内完成）。5. 从标准溶液和所测样品的562 nm光密度值中减去空白溶液的相应吸收值，即得到净吸收值。然后，以牛血清白蛋白浓度为横坐标，以相应的562 nm净吸收值为纵坐标作标准曲线。用标准曲线判定每个未知样品的浓度。 第三章 DNA-蛋白质相互作用研究方法一、 凝胶迁移率变动实验 (gel shift or electrophoretic mobility shift assay)凝胶迁移率变动实验又称凝胶滞留法（gel retar

32、dation assay）或迁移率改变法（mobility shift assay），是检测DNA结合蛋白的一种简单迅速而又灵敏可靠的实验方法。凝胶迁移率变动实验的基本原理是：当DNA结合蛋白与相应的DNA片断或寡核苷酸结合而形成DNA-蛋白质复合物后，使DNA片段的分子量及电荷发生改变，因而在聚丙烯酰胺凝胶电泳体系中其电泳迁移率发生改变，通常较游离的DNA片段的泳动速率慢得多，在放射自显影X光胶片上形成一较游离DNA片断滞后的带型。（一） DNA片段的制备DNA片段的长度一般要求在300 bp一下。DNA片断过大，在聚丙烯酰胺凝胶中不易分离，DNA片断泳动速度的轻微改变不易监测到。1. 对于

33、DNA酶切片段，需用牛小肠碱性磷酸酶（CIAP）去除DNA片段中的5 磷酸，具体方案如下：在40 l体系中， 加1 l CIAP (0.1 U/l), 37保温15分钟，56保温15分钟；再用CIAP处理一次；用苯酚/氯仿抽提一次，向上清中加入5 mol/L NaCl至终浓度为0.2 mol/L, 以及两倍体积无水乙醇，-20过夜；12,000 rpm离心5分钟以沉淀DNA。 DNA溶于双蒸水中。2. 对于合成的单链DNA片断，需要退火，具体方案如下：将两条互补的单链DNA片断分别溶解于双蒸水中，在EP管中等摩尔数混合后，放入100水中，自然冷却到37以下。（二） DNA片段的标记1. 在一个

34、洁净的EP管中，分别加入下列组分：DNA片段 5-6 pmolT4多聚核苷酸激酶10×Buffer 1 l-32PATP (3,000 Ci/mmol, 10 Ci/l) 2 l或 -32PATP (5,000 Ci/mmol, 10 Ci/l) 3 l加水至总体积为9 lT4多聚核苷酸激酶（5-10 u/l） 1 l2. 混匀，37保温10分钟。3. 加1 l 0.5 mol/L EDTA终止反应。（三） 游离-32PATP的去除 1. 对于小于18 bp的DNA片断，可用G-25离心柱去除其中未结合的-32PATP。 2. 对于大于18 bp的DNA片断，可用乙醇沉淀的方法去除其

35、中未结合的-32PATP，具体方案如下： 加0.5倍体积的7.5 mol/L乙酸铵和两倍体积的无水乙醇，-70放置30分钟；12,000 rpm离心5分钟以沉淀DNA；DNA溶于50l双蒸水中，即为32P标记的DNA片断溶液。32P标记的DNA片断溶液可放在密闭的铅罐中，并保存在-20备用。（四） 迁移率变动实验32P标记DNA片断的量一般为0.1-1 ng，可根据具体情况适当增减，以能形成清晰的滞后带而游离DNA带又不过浓为宜；蛋白质的量为0.1-10 g，应进行预实验摸索出适宜的蛋白质加入量。以能形成清晰的滞后带，而又有适量的游离DNA带残存为宜。1. 在无菌的EP管中建立下列反应：反应1

36、（负对照）：7 l 双蒸水2 l Gel Shift Binding 5×Buffer0 l 蛋白质溶液9 l 总体积反应2（正对照）： l 双蒸水2 l Gel Shift Binding 5×Buffer l 蛋白质溶液9 l 总体积反应3（专一性竞争物）： l 双蒸水2 l Gel Shift Binding 5×Buffer l 蛋白质溶液1 l 未标记的DNA片断（5-6 pmol）9 l 总体积2. 室温放置5-10分钟，然后在上述每个反应管中分别加1 l 32P标记的DNA片断。3. 室温放置20分钟。4. 仅在负对照反应管中加1 l 凝胶上样10&

37、#215;Buffer。在300伏预电泳10分钟后，反应产品通过一个4%的非变性聚丙烯酰胺凝胶分析5. 在电泳后，用吸水纸吸去凝胶上多余的溶液，然后，用保鲜膜覆盖，并夹在X光片与增感屏之间；-70过夜进行放射自显影。溶液或试剂的配方：1. Gel Shift Binding 5×Buffer20% 甘油5 mM MgCl22.5 mM EDTA2.5 mM DTT250 mM NaCl50 mMTris-HCl, pH 7.50.25 mg/ml poly(dI-dC)·poly(dI-dC)2. Gel loading 10×Buffer250 mM Tris-

38、HCl, pH 7.50.2% 溴酚兰40% 甘油3. TBE 10×Buffer (1升)107.80g Tris55g 硼酸7.44g disodium EDTA·2H2O4. 4%非变性聚丙烯酰胺凝胶（20 ml）TBE 10×Buffer 1.0 ml2% bisacrylamide 500 l40% acrylamide 2.0 ml80% 甘油 625 l双蒸水 15.9 mlTEMED 10 l10% 过硫酸铵 150 l二、 表面等离子共振 (Surface Plasmon Resonance) 实验1. DNA探针的制备合成两条互补的5-生物素标

39、记的单链DNA片段（PAGE纯化），并用结合缓冲液（10 mmol/L Tris, 30 mmol/L NaCl, pH 7.6） 配成终浓度为100 g/ml的溶液。该DNA溶液在95保温5分钟，然后自然冷却到37以下，即达到了退火的目的。2. DNA的偶联DNA溶液在25下流经感应片SA-5 (Amersham Pharmacia Biotech)，流速为5 l/min，注射时间为10分钟，再用0.05%的SDS冲洗。3. DNA结合蛋白质与DNA结合的动力学分析将DNA结合蛋白质用稀释缓冲液 (10 mmol/L Tris，50 mmol/L EDTA，0.05 mmol/L DTT，5

40、0 mmol/L NaCl，1 mmol/L MgCl2，4% Glycerol，pH 7.5) 稀释到实验浓度 (856 nmol/L、572 nmol/L、286 nmol/L、143 nmol/L及71.5 nmol/L)。 蛋白质溶液以30 l/min的流速流过偶联有DNA的感应片。其中，结合时间为120秒， 解离时间为180秒。再用0.05% SDS再生，从而得到不同浓度的E2F1 DNA结合结构域蛋白质的动力学结合曲线。然后，动力学曲线经BIA evaluation version 3.1 软件处理后，即可得到E2F1 DNA结合结构域与DNA的结合常数、解离常数、平衡常数及亲和常数。