微生物学实验教案(10生物).docx

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1、 攀枝花学院 Panzhihua University教 案 20112012学年度第一学期课 程 名 称 微生物学实验 学 时(学 分) 22（1.5） 适 用 班 级 2010级生物工程班 授 课 教 师 曹 慕 岚 教 师 职 务 讲 师 教 学 单 位 生物与化学工程学院 教 务 处 制实验教案编写说明1、实验教案的编写要求参照攀枝花学院教案编写规范（攀院教200704号）执行。2、实验教案格式可按附后“实验教案”格式采用手写或打印。3、实验教案的基本内容可包括：教学目的与要求、教学重点与难点、仪器设备及用具、教学过程(含实验预习检查实验原理及方法仪器设备介绍实验内容及注意事项实验指导

2、要点检查实验结果)、实验预做记录(含原始实验数据记录数据处理及结果分析)、实验预习要求、实验报告要求、参考书目、后记等相关内容。4、实验教案编写应在坚持教案编写基本要求的基础上，充分考虑教师自身条件和学科的差异，针对教师、学科、学生以及教学情景的不同，编写出形式多样，能体现教学风格、具有特色的教案，促进教案的创新。5、教案编写水平的高低，很大程度上取决于教师钻研教材与实验方法，研究学生实际状况和设计教学方法的水平，取决于教师对本学科知识掌握的深度和广度以及教师教育思想的端正更新。因此，教师应努力提高自身素质，提高教师教案编写水平。实 验 教 案实验课程名称微生物学实验实验学时22独立设课 非独

3、立设课实验课类别1.基础 2.专业基础 3.专业 4.其它任课教师曹慕岚职称讲师授课对象年级：2010级 专业：生物工程 班级： 本科专科教材和主要参考资料教材：沈萍等主编.微生物学实验M.高等教育出版社.2006年.主要参考资料：1、焦瑞身,周德庆主编.微生物生理代谢实验技术.科学出版社.2、范秀容,李广武.微生物学实验（第二版）.高等教育出版社3、周德庆.微生物学实验手册.上海科学技术出版社.教学目的和教学要求掌握显微技术、接种技术、灭菌技术、菌种培养与保藏等方面的基本概念、基本理论和基本技能，为今后学习专业方向课奠定必要的基础。教学重点和教学难点重点：各种微生物学的基本实践技术难点：各种

4、微生物学的基本实践技术教学进程安排课次实验项目（实验内容）学时备 注1显微镜使用、细菌简单染色及革兰氏染色实验42放线菌、霉菌形态观察实验43酵母菌形态观察和大小测定实验44细菌培养基配制细菌的培养实验65实验考试4实 验 教 案课题(项目)名称: 显微镜使用、细菌简单染色及革兰氏染色计划学时: 4 实验类型: 1.演示性 2.验证性 3.综合性 4.设计性 5.其它授课日期: 2012 年 4月 3 日 第7 周 星期 二 第 5/6/7/8 节实验一 显微镜使用、细菌简单染色及革兰氏染色一、目的要求1、学习并掌握油镜的原理和使用方法2、复习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法3、学

5、习微生物涂片、染色的基本技术4、掌握细菌的简单染色法5、初步认识细菌的形态特征6、巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术7、学习并初步掌握革兰氏染色法8、了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性二、基本原理1、显微镜的工作原理：普通光学显微镜是一种精密的光学仪器。以往最简单的显微镜仅由几块透镜组成，而当前使用的显微镜由一套透镜组成。普通光学显微镜通常能将物体放大15002000倍。普通光学显微镜的构造可分为两大部分：一为机械装置，一为光学系统。在显微镜的光学系统中物镜的性能直接影响显微镜的分辨率。2、细菌简单染色及革兰氏染色的基本原理：用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和

6、中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳

7、性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。三、器材1、活材料：培养12-16h枯草杆菌（Bacillus subtilis）2、染色液和试剂：结晶紫（

8、附二、（一）、3）、卢哥氏碘液（附二、（一）、4）、95%酒精、蕃红（附二、（一）、5）、复红（附二（一）、2）、二甲苯、香柏油3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜四、操作步骤1、显微镜的使用（1）观察前的准备1）显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将显微镜搬运到实验桌上。2）将显微镜放在自己身体的左前方，离桌子边缘约10cm左右，右侧可放记录本或绘图纸。3）调节光照 不带光源的显微镜，可利用灯光或自然光通过反光镜来调节光照，但不能用直射阳光，直射阳光会影响物像的清晰并刺激眼睛。将10×物镜转入光孔，将聚光器上的虹彩光圈打开

9、到最大位置，用左眼观察目镜中视野的亮度，转动反光镜，使视野的光照达到最明亮最均匀为止。光线较强时，用平面反光镜，光线较弱时，用凹面反光镜。自带光源的显微镜，可通过调节电流旋钮来调节光照强弱。4）调节光轴中心 显微镜在观察时，其光学系统中的光源、聚光器、物镜和目镜的光轴及光阑的中心必须跟显微镜的光轴同在一直线上。带视场光阑的显微镜，先将光阑缩小，用10×物镜观察，在视场内可见到视场光阑圆球多边形的轮廓像，如此像不在视场中央，可利用聚光器外侧的两个调整旋钮将其调到中央，然后缓慢地将视场光阑打开，能看到光束向视场周缘均匀展开直至视场光阑的轮廓像完全与视场边缘内接，说明光线已经合轴。（2）低

10、倍镜观察镜检任何标本都要养成必须先用低倍镜观察的习惯。因为低倍镜视野较大，易于发现目标和确定检查的位置。将标本片放置在载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观察的标本处在物镜正下方，转动粗调节旋钮，使物镜调至接近标本处，用目镜观察并同时用粗调节旋钮慢慢升起镜筒（或下降载物台），直至物像出现，再用细调节旋钮使物像清晰为止。用推动器移动标本片，找到合适的目的像并将它移到视野中央进行观察。（3）高倍镜观察在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。较好的显微镜，低倍、高倍镜头是同焦的，在正常情况下，高倍物镜的转换不应碰到载玻片或其上的盖玻片。若使用不同型号的物镜，在转换物镜时要从侧面观察，避免镜头与玻片相

11、撞。然后从目镜观察，调节光照，使亮度适中，缓慢调节粗调节旋钮，使载物台上升（或镜筒下降），直至物像出现，再用细调节旋钮调至物像清晰为止，找到需观察的部位，并移至视野中央进行观察。（4）油镜观察油浸物镜的工作距离（指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离）很短，一般在0.2mm以内，再加上一般光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”，因此使用油浸物镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损。使用油镜按下列步骤操作：1）先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约2cm，并将高倍镜转出。2）在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。3）从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，（或镜筒下降

12、），使油浸物镜浸入香柏油中，使镜头几乎与标本接触。4）从接目镜内观察，放大视场光阑及聚光镜上的虹彩光圈（带视场光阑油镜开大视场光阑），上调聚光器，使光线充分照明。用粗调节旋钮将载物台徐徐下降（或镜筒上升），当出现物像一闪后改用细调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物象，必须再从侧面观察，重复上述操作。5）观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚酒精混合液（乙醚2份，纯酒精3份）或二甲苯，擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭23下即可，（注意向一个方向擦拭）。6）将各部分还原，转动物镜转换器，使物镜头不与载物台通光孔相对，而是成八字形位置

13、，再将镜筒下降至最低，降下聚光器，反光镜与聚光器垂直，用一个干净手帕将接目镜罩好，以免目镜头沾污灰尘。最后用柔软纱布清洁载物台等机械部分，然后将显微镜放回柜内或镜箱中。2、简单染色：（1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂苏云金杆菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌液。再取干净载玻片一块将刚制成的苏云金杆菌浓菌液挑2-3环涂在左边制成薄的涂面，将大肠杆菌的浓菌液取2-3环涂在右边制成薄涂面。亦可直接在载玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。（2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（

14、以不烫手为宜）（4）染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色1-2min。（5）水洗：用水洗去涂片上的染色液（6）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。（7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。3、革兰氏染色：（1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。（2）晾干：与简单染色法相同。（3）固定，与简单染色法相同（4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟。（5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。（6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min

15、。（7）水洗：用水洗去碘液。（8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色2025s至流出液无色，立即水洗。（9）复染：滴加蕃红复染5min。（10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。（11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。（12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。（13）实验完毕后的处理：将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦23次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦23次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净。五、实验报告给出菌的形态图，并注明菌的革

16、兰氏染色的反应性。六、注意事项1搬动显微镜时，要一手握镜臂，一手扶镜座，两上臂紧靠胸壁。切勿一手斜提，前后摆动，以防镜头或其他零件跌落。2观察标本时，显微镜离实验台边缘应保持一定距离(5cm)，以免显微镜翻倒落地。镜柱与镜臂间的倾斜角度不得超过45度，用完立即还原。3使用时要严格按步骤操作，熟悉显微镜各部件性能，掌握粗、细调节钮的转动方向与镜筒升降关系。转动粗调节钮向下时，眼睛必须注视物镜头。4观察带有液体的临时标本时要加盖片，不能使用倾斜关节，以免液体污染镜头和显微镜。5粗、细调节钮要配合使用，细调节钮不能单方向过度旋转，调节焦距时，要从侧面注视镜筒下降，以免压坏标本和镜头。6用单筒显微镜观

17、察标本，应双眼同时睁开，左眼观察物像，右眼用以绘图，左手调节焦距，右手移动标本或绘图。7禁止随意拧开或调换目镜、物镜和聚光器等零件。8显微镜光学部件有污垢，可用擦镜纸或绸布擦净，切勿用手指、粗纸或手帕去擦，以防损坏镜面。9凡有腐蚀性和挥发性的化学试剂和药品，如碘、乙醇溶液、酸类、碱类等都不可与显微镜接触，如不慎污染时，应立即擦干净。不要任意取下目镜，谨防灰尘落入镜筒。10使用油镜观察样品后，随即用二甲苯将油镜镜头和载波片擦净，以防其他的物镜玻璃上沾上香柏油。二甲苯有毒，使用后马上洗手。11实验完毕，要将玻片取出，用擦镜纸将镜头擦拭干净后移开，不能与通光孔相对。用绸布包好，放回镜箱。切不可把显微

18、镜放在直射光线下曝晒。12革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。13染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。14选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。七、思考题1、为什么要求制片完全干燥后才能使用油镜？2、如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高、时间太长，又会怎样呢？实 验 教

19、案课题(项目)名称: 放线菌、霉菌形态观察计划学时: 4 实验类型: 1.演示性 2.验证性 3.综合性 4.设计性 5.其它授课日期: 2012 年 4 月 10 日 第 8 周 星期 二 第5/6/7/8 节实验二 放线菌、霉菌形态观察一、目的与要求1、学习并掌握观察放线菌、霉菌形态的基本方法2、初步了解放线菌及四种常见霉菌的基本形态特征二、基本原理1、放线菌形态观察放线菌自然生长的个体形态的观察现多用玻璃纸琼脂透析培养法。玻璃纸具有半透膜特性，其透光性与载玻片基本相同，采用玻璃纸琼脂平板透析培养，能使放线菌生长在玻璃纸上，然后将长菌的玻璃纸剪取小片，贴放在载玻片上，用显微镜镜检可见到放线

20、菌自然生长的个体形态。采用插片培养法也能观察放线菌的个体形态。2、霉菌形态观察霉菌的营养体是分枝的丝状体。其个体比细菌和放线菌大得多，分为基内菌丝和气生菌丝。气生菌丝中又可分化出繁殖丝。不同霉菌的繁殖菌丝可以形成不同的孢子。霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，且孢子容易飞散，所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。此染色液制成的霉菌标本片的特点是：细胞不变形，具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长时间，溶液本身呈蓝色，有一定染色效果。利用培养在玻璃纸上的霉菌作为观察材料，可以得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌形态；也可以直接挑取生长在平板中的霉菌菌体制水浸片观察。三、器材1、活材料：培养5-7天的

21、紫色直丝链霉菌（Streptomyces violaceorectus）的斜面菌种、吸水链霉菌5102（Streptomyces hygroscopicus var.Yingchengensis(5102)）斜面菌种；在马铃薯琼脂平板上或用玻璃纸透析培养法培养34天的根霉（Rhizpus sp.）、青霉（Penicillum sp.）、曲霉（Aspergillus sp.）。2、培养基：高氏一号琼脂培养基（见附录一、10）3、染色液和试剂：乳酸石炭酸棉蓝染色液（附录二、（一）、10）、50%酒精（V/V）。4、器材：剪刀、镊子、载玻片、盖玻片、解剖针、显微镜、无菌平皿、玻璃纸、 9ml无菌水若

22、干支、酒精灯、火柴、接种环、玻璃刮铲、1ml无菌吸管、载玻片。四、操作步骤1、放线菌形态观察（1）将玻璃纸剪成培养皿大小，用旧报纸隔层叠好后灭菌。（2）将放线菌斜面菌种制成103的孢子悬液。（3）将高氏一号琼脂培养基熔化后在火焰旁倒入无菌培养皿内，每皿倒15ml左右，待培养基凝固后，在无菌操作下用镊子将无菌玻璃纸履盖在琼脂平板上即制成玻璃纸琼脂平板培养基。（4）分别用1ml无菌吸管取0.2ml吸水链霉菌（5102）孢子悬液，紫色直丝链霉菌孢子悬液分别滴加在两个玻璃纸琼脂平板培养基上，并用无菌玻璃刮铲涂抹均匀。（5）将接种的玻璃纸琼脂平板置2830下培养。（6）在培养至3天，5天，7天时，从温室

23、中取出平皿。在无菌环境下。打开培养皿，用无菌镊子将玻璃纸与培养基分离，用无菌剪刀取小片置于载玻片上用显微镜观察。2、霉菌形态观察采用制水浸制片观察法在载玻片上滴加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液或蒸馏水，用解剖针从生长有霉菌的平板中挑取少量带有孢子的霉菌菌丝，用50%的乙醇浸润，再用蒸馏水将浸过的菌丝洗一下，然后放入载玻片上的液滴中，仔细地用解剖针将菌丝分散开来。盖上盖玻片（勿使产生气泡，且不要再移动盖玻片），先用低倍镜，必要时转换高倍镜镜检并记录观察结果。五、实验报告1、绘出放线菌自然生长的个体形态图。2、给出根霉、青霉、曲霉的个体形态图，并注明各部位名称。六、关键步骤及注意事项1、倒平板要厚一些，

24、接种时划线要密。2、插片时要有一定角度并与划线垂直。3、观察时，宜用略暗光线；先用低倍镜找到适当视野，更换高倍镜观察。 4、如果用0.1%美蓝对培养后的盖玻片进行染色后观察，效果会更好。七、思考题1、为什么在培养基上放了玻璃纸后，放线菌仍能生长？2、镜检时，你如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝?3、你认为霉菌和放线菌菌丝的主要区别是什么？实 验 教 案课题(项目)名称: 酵母菌形态观察和大小测定计划学时: 4 实验类型: 1.演示性 2.验证性 3.综合性 4.设计性 5.其它授课日期: 2012 年 4 月 17 日 第 九 周 星期 二 第 5/6/7/8 节实验三 酵母菌形态观察和大小测

25、定一、目的和要求1、观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法2、掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别3、了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造和使用原理，掌握微生物细胞大小的测定方法二、基本原理1、关于形态观察的原理本实验是通过美蓝染液水浸片和水-碘液水浸片老观察酵母的形态。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则是蓝色或淡蓝色。2、关于细胞大小测定的原理微生物细胞大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微

26、生物大小测定，需在显微镜，借助特殊的测量工具目镜测微尺和镜台测微尺。镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，目镜测微尺是块可放入接目镜内心圆形小玻片，测量时，需将其放在接目镜中心的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物象。球菌用直径来表示大小，杆菌则用宽和长的范围来表示。目镜测微尺三、实验器材1、菌种 酿酒酵母2、试剂0.05%和0.1%吕氏碱性美蓝染色液，革兰氏染色液用碘液。3、仪器或其他用具 显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、载玻片、盖玻片等四、操作步骤1、美蓝浸片的观察（1）按无菌操作取少量酵母菌与0.1吕式碱性美蓝染色液混合均匀，放置约3min后，先用低倍镜后用高倍镜观察酵母的形态和

27、出芽情况，并用颜色区别死活细胞。（2）染色0.5h后再次观察，注意死细胞是否增加。（3）用0.05吕式碱性美蓝染色液重复上述操作。2水碘液浸片的观察：先滴加碘液后加水，取少量酵母菌混合均匀，盖上盖玻片观察。3、细胞大小的测定(1)取一滴酵母菌菌悬液制成水浸片或HD-1菌悬液。(2)移去镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量酵母菌（或HD-1）菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽。一般测量菌体的大小要在同一个标本片上测定1020个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小。而

28、且一般是用对数生长期的菌体进行测定。五、实验报告 绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征，并测定其大小。六、注意事项1、加染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡而影响观察。2、盖玻片不宜平着放下，以免产生气泡影响观察。3、注意目测尺与物测尺的关系。4、注意区分酵母菌的假丝状体。七、思考题1吕式碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响？试分析其原因？2在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌？实 验 教 案课题(项目)名称: 细菌培养基配制细菌的培养计划学时: 6 实验类型: 1.演示性 2.验证性 3.综合性 4.设计性 5.其它授课日期:

29、 2012 年 4 月 24 日 第 十 周 星期 二 第 5/6/7/8/9/10 节实验四 细菌培养基配制细菌的培养一、目的要求1明确细菌培养基的配制原理；2通过对培养基的配制，掌握配制细菌培养基的一般方法和步骤；3了解细菌在细菌培养基上的培养过程。二、基本原理培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，含有牛肉膏、蛋白胨和氯化钠。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而氯化钠提供无机盐。牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：牛肉膏

30、 3.0g蛋白胨 10.0gNaCl 5.0g水 1000mlpH 7.4-7.6三、器材1菌种、溶液或试剂琼脂，1mol/L NaOH，1mol/L HCl；牛肉膏蛋白胨培养基。2仪器或其他用具试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸(pH5.59.0)，棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。四、操作步骤1称量 按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白胨很易吸

31、潮，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。 2溶化 在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。 3调pH 在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达76。反之，

32、则用1mol/L HCl进行调节。注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。 对于有些要求pH值较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行 4过滤 趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利结果的观察。一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去（本实验无需过滤）。 5分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。 分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。 (1)液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。 (2)固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。 (3)半固体分装试管

33、一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。 6加塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。 7包扎 加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。 8灭菌 将上述培养基以105kg/cm2（15磅/英寸2），1213， 20分钟高压蒸汽灭菌。 9搁置斜面 将灭菌的试管培养基冷至50左右，将试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜

34、面长度以不超过试管总长的一半为宜。 10接种培养五、实验报告包括如下内容，写作规范严格按照统一的要求：（1）实验目的（2）实验原理（3）实验所需仪器设备及用品（4）实验步骤（5）实验阶段性结果（6）实验结果与分六、实验注意事项1、高压蒸汽灭菌步骤及注意点：（1）首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水。（2）放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。（3）加盖，以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓。（4）水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀。（5）当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用 105kg/cm2，121.3，20分钟灭菌。（6）灭菌所需时间到

35、后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，（7）将取出的灭菌培养基放入 37温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。2、加热溶化过程中，要不断搅拌，以固体物质粘在烧杯底上烧焦，造成烧杯破裂，加热过程中所蒸发的水分应补足。3、培养基的灭菌时间和温度，需按照各种培养基的规定进行，以保证杀菌效果和不损失培养基的必要成分，培养基灭菌后，必须放在37ºC温箱培育24h，无菌生长方可使用。4、培养基的pH要调合适。5、细菌接种过程必须保证在无菌状态下进行。七、思考题1、培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？2、在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？3、配制合成培养基加入微量元素时最好用什么方法加入？天然培养基为什么不需要另加微量元素？4、有人认为自然环境中微生物是生长在不按比例的基质中，为什么在配制培养基时需要注意各种营养成分的比例？第 页