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1、【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创）双陽切连接反应之全攻略2周車组了 14个质粒。现就自己的体会. 结合战友的宝贵经验.谈一卜质粒虫组的一些个人经脸1、回收心产物】在进fj PCR如BamHI, Hindlll,提洲看好各公司的双切酚所用公用的BUFFER以及齐廊在公用BUFFER里的 效率。选好觴切位点后.在各个酹的两边加上保护碱垄其原则町觀照：2006/OS/13双酶切时间及其体系】需要賤调的足很多人建议醉切过夜其实完全没有必要我一股陽切3个小时.其实1个小时已经足够。 应用人体系.如100微升。纯化问题：纯化PCRM以祛除引物既然如此.阳切掉的几个倣基用定也仝被纯化掉了所以.PCR产物
2、和双的切产物的纯化均町应用柱 式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶童的问题：以TAKARA的为例其对1单位醉的定义如卜：在50 U1反应液中.30'C温度卜反应1小时.将1机 的入DNA 完全分解的陽撤定义为1个活性单位（而该陽浓度约为15单位/徹升.在除外葩降解的因索外该酸对分15UB的D、A 而股从1-tml 液捉出的DXA约为3叱.而PCR纯化后的产物（50体系）约为3叱所以即便全部加进去只要纯化的质 fit好.醉切完全切得动。2、|»切、回收后的 心产物与载体的连接PCR产物片段=1：10 一妣取曲者.后者取mol为单位的DXA转换为为陀单位的DXA： （X
3、pmolesX长度bpX650）/ 1, 000, 000 （注：长度bpX650 该双链DXA的分 子#：所得数值即为恕，也可以宜接用这个公式套.lpmol lOOObp DXA= P g.如较体是53S0bp.则为xx=际测DNA浓度町以在S川机子上测注总OD ffi. 一股约另外如果嫌麻烦也叩MARKER进行估测Ul MARKER2000. 5微升的MARKER 毎个条带约50ns连接反应:TAKARA的连接说匕的 说明写的过夜而其对连接醉单位的定义为:在20讥的连接反应体系中6叱的XDNA-Hind III （f）分解物1G C F反应30分钟时.有9S以上的DXA片段被连接所得要的醉
4、fit定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为 350 U/U1 .所以完全够用连接醉容易失活注虑低温操作.最好在冰上时側3个小时足已。3. 转化：冬 全址（10 U1）加入至100 U1 JM109S受态细胞中.冰中放JS 30分钟。b、429加热45秒钟后,再在冰中放分钟.c、加入彫0 Hl AMP阴性培养基.37X?tti荡培养60分钟，取100 ul铺板，也对离心后100 U 1几个非常$要的何题1做转化的时候，进行阿连接反应时，注总保持低温状态，因为LIGASB酶很容易降解.为保掩起见,-般连接3小时,16度.2对含YfAXP-RHSISTENCE的质粒铺板时，注恋加8时的温度，温度过
5、高，会使克隆株无法筛选出来.我的方法足培基高温消僚后放在烤箱里.烤箱-妣温度为5570铺板前后注怠用吹风机吹干3对照的设立，为脸证双幽切是否成功，町做如卜对照：A陽切反应时加备单钢分别切，两悅用同种BUFFER,抠胶,看单切的两管足否成线性.如两管均成线性吋初步刿断双酚切成功.做转化时也耍进行对照.设4个：A. 即京双陽切的质粒产物也进行连接反应，这个对照吋进一步看双醉切足否成功，如果长出克隆，说明很有町能只进行了单说切，如没长出克隆，則证明双酚切成功，当然要保证感受态，培基，连接脇都'正幣'的悄况卜IB. 陽切过的未进行连搖反应的双龄切产物，进行转化，这一步町以证明足否有残留
6、的未被任何陽切的原始质籾C. 设原始质粒为对照，总为检测整个操作过程中是否冇误.阴性板t：用同一批感受态细胞铺板20微升足够，检测感受态状况.4. 所有的试剂切记低温保存一步一个脚印不要偷tti,图省事眾后却更费爭注总设立对照.经PCR鉴定.克隆ggrog的阳性率.所以在后面的 挑克隆中.我只挑选4个就足够了。然后双醉切鉴定测斥 希望人家不断补充.Dine - E和我的方法差不多.连接前最好将水、插入片段和我体混合好以后甦干45度水浴5min马上越冰I：冷却.再加入buffer和limsisprintvtl wrot:用2周觅组了 14个质粒. 这个效率非常不锚！佩股!soartkevin w
7、rote:Dine - E和我的方法差不多.连接前最好将水、插入片段和较体混合好以后置干45度水浴5min弓上置于冰I：冷却.再加入buffer ligase-这个操作足什么原理？为什么要选择15C?具实也不一定45度.估计50度也行 45度对于几个减基结合（葩切位点）的打开绰竦有余.分子克隆3的经典操作.个人认为主要目的如卜：插入片段和载体在之前的操作过程中有部分粘性末端己经匹配.如果自接连接町能会有多重插入和参戦体自连的侑况 45度处 理足其粘性末端打开由于片段与栽体混合、狈热后马上賈于冰上.使得片段与栽体浪人限度匹配从而提高连接效率.sprincvel wrot:障量的问题：以TAKAR
8、A的为例.其对1单位前的定义如卜：在50 H1反应液中.30'C温度卜反应1小时.将1肌 的入DXA 完全分解的脇瑕定义为1个活性单位00.而该酚浓度约为15单位/徹升.在除外葩降解的因素外该前町分斛15心的DNA而_般从Llml菌液提岀的DNA约为3"而PCR纯化后的产物（50体系）约为3吒所以即便全部加进去.只要纯化的质 fit好.醉切完全切得动。color=rtd但是公司给推看的一般都足2. Oul体系加21,其实我有的时候为了省酶在20ul只加酶，切的也很好.我不明白的是.我们一般的质粒载体是否象ITaDNA样好切.如果是那样的话，100U1体系加lul可能也够了.会
9、省好多钱啊，尤其是有的臨一支才lOul.按推荐做两个lOOul体系需要两亀 不知道有人试过没有smartkevin wrote:其实也不一定45度，估计50度也行，45度对于几个礙基结合（酶切位点）的打开绰绰有余分子克隆3的经典操作，个人认为主要目的如下：插入片段和载体在之的的操作过程中有部分粘性末瑞已经匹配如果宜接连接可能会有多直插入和多载体自连的情况，45度处理足其粘性末瑞打开.由于片段与载体混合、預热后马上置于冰上，使得片段与栽体最大限度匹配，从而提高连接效率.如果真的是这样我觉得对于非同源粘性末端和平末瑞作用不大，对于同源粘性末端可能有作用.不知道还有没有其他的解释?我倒足没有仔细看过
10、分子克隆.nybbff wrot:如果真的是这样我觉得对于非同源粘性末瑞和平末瑞作用不大，対于同源粘性末端可能有作用.不知道还有没有其他的解释? 我倒足没有仔细看过分子克隆.刚才査了一下分子克隆3,只说了一句“以消除重新复性而导致的末靖相互聚合”（中文版P71） 其实如果是粘性末瑞酶切的话郴是有用的，无所谓菲同瀕和同瀕末靖，就算是非同瀕末端，戟体和戟体，片段和片段也能聚合对于平末端应该就没有什么作用了 autumnsun wrot:但足公司给推看的一般都足2. Oul体系加21,其实我有的时候为了省Sb在20ul只加酶，切的也很好.我不明白的是，我们一般的质粒戟体足否St lamda DNA一
11、样好切，如果足那样的话，lOOul体条加lul可能也够了.会省好多钱啊，尤其足有的酶，一支才Khd.按推荐童加.做两个lOOul体系需要两管，不知道有人试过没有如果100U1里的DMA太多了也不行啊.酶和DNA还是要匹配的我不明白的是，我们一般的质粒戟体是否St landa DNA一样好切，如果是那样的话，lOOul体系加lul可能也終了，会省好多 钱啊，尤其是有的晦，一支才10ul,按推荐量加，做两个lOOul体系需契两管，不知道有人试过没有其实徐了考虫IW浓度（每微升多少个单位）以外还应该考虎这种胸在lamda DNA上的酶切位点数目.比如用Hindi和Xbal 双切PUC118,这两个酶
12、在DUC118上都只有一个酶切位点，而在lamdaDXA上的酶切位点分别是35个和1个.根据酶活性的圧 义.相同单位的HincII和XbM对PUC118的酶切效率是35比1,所以在双酶切体系中，所用的Hindi显燃应该要少很多.好！ ! I真实用！ ! 1“回收的戟体片段：回收的PCK产物片段=山10 , 一般取前者，后者取 ”是不是应该前者.后者精华1投你一票!asher vrot:好！ 1 I真实用I ! 1“回收的裁体片段；回收的PCR产物片段：:b 10 , 一般取肪者.后者取。”是不是应该前者.后者辑？已经改了 谢谢!昨天14做转化时也要进行对風.设4个：A. 即拿双醉切的质粒产物也
13、逬行连接反应，这个对凤可逬一步君双酶切足否成功,如果长出克隆，说明很有町腌只进行了单酶切. 如没长出克隆，则证明双酶切成功，当然耍保证感受态，培基，连接酶都'正謝的情况下.B. 酶切过的未进行连接反应的双酶切产物，进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒C. 设原始质粒为对照，怠为检测整个操作过程中足否有课.阴性板上用同一批感受誉细胞铺扳20微升足够，检测感受态状况.就上面的对RR简要说一下我的结果。转化后第二天可见14个标本的平皿上长了很多克隆.约100个左右.我用的足宜径6cm 的板子，所以仍显较多，（我是先挑半个克隆并标记好行PCK鉴定后再对另外的一半进行揺菌抽
14、提质粒），较难挑克隆，所以 铺皿时不用离心，宜接用100微升的舗皿就町以了.我其中一个足这样做的，长得克隆较大，很好挑选.下面简要的说一下对睨的结呆A只长出了 3个克隆，以100的基数计算，约为3%.即双酶切反应中质粒只有3%进行了单酶切B约有5个克隆，即质粒完全没被切动的约5%c长了很多克隆，证明操作系统没有问AL为系统控制指标.D长了很多克隆，证明感受态没有问题这些对照相辅相成，扬长避短万一什么都没作出来也好分析原因JM108感受态细胞的劇备 刚开始做实验时，是向TAKARA购买的.一支30元.定了 10支。后来干腑自己做，感觉质量和TAMARA的质量不相上下.下面 谈谈我制作感受态的体会
15、.加期工作分子生物耗费时间在于准备过程太多。所以做好肮期工作非常里要.所谓'磨刀不谋砍材功'注意事项1. 不要用经过多次转接或储于4 9的培养菌，最好从一70P或P09甘油保存的蘭种划板（8阴性37度过夜培养，划板时 用小TIP头挑少许冰渣即可.轻划Sff.同时记得设立对照：A x在AMP阳性板划菌，排出AMP抗性菌污染。大家都知道.实 脸室很多材料从师姐传师妹，或许经过很多人的转手.所以从头鉴定所用材料的町義性非常必要.B. AMPTIP头不沾任何东西进疔划板.第二天挑克隆2. 质粒的质遗和浓度：用于转化的质粒DNA应主要足超螺旋态DNA（cccDNA） 转化效率与外源DNA
16、的浓度在一定范慚内成正比， 但当加入的外源DNA的量过多或体枳过大时，转化效率戏会降低 5.的cccDNA即町使50 U 1的感受态细胞达到饱和一般悄 况下,DXA溶液的体枳不应趙过感受态细胞体枳的5%.不过我一般链接反应后（TAKARA的链接酶，体系25微升）会全童加到 200微升的感受态虽.约为150n< （裁体微克.目的片段约微克）效果也好。3. 试刑的质童：所用的试剂，如CaC12等均需足最高纯度的（GR.或AR.）,并用超纯水配制，最好分裟保存于干燥的冷暗处.国 产的当然也可以.我用都足国产的，好像足陇西化学制剂，分析纯4. 防止杂福和杂DNA的污集r整个操作过程均应在无甫条件
17、下逬行，所用器皿，如离心管，头等最好足新的，并经高压灭 菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂.DMA酶或杂DNA所污染，否則均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以 后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦.培养基的配制1.配制LB-AMP抗性培养基LB液体培养基：精解蛋白豚10酵母抽提物5欽 氯化钠10.,加去离子水800m：L充分搅拌洛解. 用lmol/LNaOHiS.补加去离子水至1000亳升，高压灭菌，4度保存。我一般没有用l»ol/LNaOH.而足宜接荊解蛋白脓10r, 酵母抽提物5的 氯化钠10加去离子水至1000ml.固体培养基：LB液体培养基中加%琼脂粉，扁压灭菌消毒
18、：母液：用无菌水或生理盐水配制成100mr/ml即100 ur/ul溶液，置P09保存；AMP500mr/支，一支用5nl稀释即得.然后分5支分裟（浓度 100®t/«l 即 100 uf/ul）.4含g的LB固体培养基：将配好的LB液体培养基高压灭網后冷却至60C左右，加入g 倚存液,使终浓搜为lOOuf/Bl摇匀 后铺板（30ml/90flim）：即多少毫升培养基加多少微升上述的Aap母液多少毫升培基=加多少微升母液，或减半终浓度为 SOur/ml有指南上场细菌转化后37度复苏时用SOC培基.我从来只用AMP阴性的普通培基.效果也很好.5. 0. 05«ol/
19、L C.C12溶液:我们实验室只有CaC12-6H20,分子量219,配制lOOol的.贝lj需称*X219=1. 095<可以了其实 氯化钙的摩尔浓度在均可.洛于50ml至热水中,定容至lOOiol,高压灭菌.6含15驚甘油的L CaC12:先配制成L的氯化钙溶液50al,加入15ml甘油，定容至100ml,高压灭亂 有文駅说要用的滤翻 其 实完全没有必耍.扁压即可.一、受体歯的培养从LB平板上挑取新活化的JM109单菌落，接种于3-151 LB液体培养基中 379下振荡培养12小时左右（一 般过夜）将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于10ml试管（如较多劇备，多用几个试管即可
20、）的LB液体（AMP阴性）培养 基中同时做空的培基对岚,37匸振荡培养2-3小时至ODGOO =左右.二. 感受态细胞的制备（CaC12法）K将培养液分转入的离心管中（一管Wail菌液可分製成约6管的离心管中），冰上放置10分钟,然后于49下3000<离心10 分钟.2、弃去上溉用预冷的L的CaC12溶液200微升轻轻悬浮细胞，冰上放置30分钟后,代下3000.离心10分钟.3、弃去上消加入200微升预冷含15%甘油的L的CaC12溶液,轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细麗悬液.4、贮存于-709可保存半年。耍点I i.&浮细麗时动作一定要轻柔I 2冰上.拿握者两点可谓掌
21、STM备感受态的m,无往不利.连接双酶切PCR鉴定目的片段是否连接上表达载体可能的原因，1表达载体双切不充分，载体量太大，而酶又加的太少，酶切时间短2连接最好是1216小时，因为你的目的片段和载体的浓度比，不是很合适3回收胶的问題今天酶切时没有和空载体对比，TE,含有EDTA,会抑制连接酶的活性洗下来后要先确定一下浓度，浓度太低可定连不上1：在使用Wash Buffer洗涤前.在柱子中加入少虽（200ul）溶胶液.室温3-5分钟后，离心。再接标 准洗涤及以后操作。该操作针对胶块大的情况。2：加入Wash Buffer后.静置1"3分钟后，再离心。3：增加Wash Buffer的洗涤次
22、数（少址女次）。胶的残留导致的问题不是单纯的胶残留问趣.同时也会导致溶胶液中盐的残留-这似乎对连接影响更大。 最好的解决方法是1:半然，可能会导致得率的小虽下降，但质虽绝对好。为了充分去除残留总结,1 多加一步200ul溶胶液.2加Wash Buffer前空柱离心30 sec. Buffer洗涤时静宜及篡次胶时应该尽啟要小，假如 过大的话分到两个柱f里应该比枚好.另外就是溶胶液宁可多加也不能少加首先要保证待测质粒的纯度，除PCR夕卜，可以对重组质粒做两个双酶切反应：I与XhO I双酹切；2选 一个插入片段中特异存在的切点曲和质粒ECoRI下游到Xbal间的合适位点酶（插入片段中没有的），进行双
23、 切，结果可以侦测到每个双切反应包括酶1尬切,臨2单切,双切三个反应，别忘了以空载休做对照试试 看如果没有得到重组质粒只好再连接反应r.曲是TAKARA的，方法就是按说明书上做的，酶各1微升,buffer 2微升，质粒5微升,20微升体系. 遇到双酹切可是两个酹没有共用buffer时两种办法 一是低盐buffer的酶先切，然后乙醇沉淀回收.然 后岛盐buffer的酚再切.乙醇沉淀或切胶回收。 也可以低盐buffer的酹先切.作用时间（一般379孵 育1小时或更长时间）充分后加高盐buffer的酶再切.然后乙醇沉淀或切胶回收。通过摸索可以积累经 验。我记得NEB推荐BamHI和Hindlll是分
24、步切。要将PCR片段连入表达载体中，选的是TaKaRa的BamH I和Hind III,请问这个双酶切是在37度反应还是 30度,要酔切多长时间?PCR片段比较难切吗，引物两端都各加f 3个保护碱基？参考见解 一般37度2小时就行.在酶切时，由干你所选用的酶都是效率比较商的，酶切一个小时就已 经足够C 不过若不放心.过夜也没问題。buffer需要共用buffer（比如Y buffer） ° PCR片段的腮切效 率与引物两端所加保护碱基有很大关系。如果保护碱基加的恰酶切应该不成问题。PCR产物.由于浓 度较低，并不难切，只是在连接转化时难以成功。BamH I 一般加CGGGATCCCG
25、的酚切效率岛达90%。其它 的的具体情况可以査NEW ENGLAND BioLabs的目录。按new england biolab的介绍，hindlll切削的时间 絞长.如果，直接切per产物再连接有时效率不岛.导致转化效率低。如果有条件的话.可以先做at克 隆，再酶切。TaKaRa的产品目录的A部分里有关干双酶切所用buffer的详细说明.最好依照执行。怎么才能鉴定质粒有没有被双酶切？参考见解：酶切后作个质粒自连实验，在感受态、连接的等没问题的情况下，如果没有菌落长出，说明双 曲切是成功的。十然.如果只长J'很少的菌落.也是可以的。如果长J'很篡的菌落.那说明的切不完全， 这
26、时候就只有一个的切位点切开r,质粒发生r自连。目的片断与载体应该是摩尔数之比为3： 16： 1 可以在转化质粒时.以空质粒为对照这样來比较 的切目的基因及质粒栽体后加Loading buffer终止反应，然后要直接进行连接反应，可以吗?耍是不行，还有一种方法就是加热灭活限制酶（用的是Hmd3/EcoRl双的切人多商温度适合啊？参考见解：1、一般直接用2倍体枳的无水乙醇沉淀目的片段 T燥后直接用水溶解连接即可。比较适用于载体和PCR 产物的连接。效果很好。2、酶切后要胶回收后再连接，另外酶切结束后，直接电泳回收不用加终止液，对连接没有影响.3、有的公司的限制酶（JaiXEB）是不需要热灭活的.而
27、有的公司的限制酹（如MBI）则需婆热灭活，一 帮是65摄氏度.10分钟。然后经凝胶回收后再作连接.目的片段与质粒的摩尔比在310： 1的范隅内连 接效果都不错。4、通常随酶附送的loading buffer是含有SDS起到灭活的作用，但在上样时会产生很多泡沫。1、做双酶切的时候用的buffer都是根据公司提供的双的切最适buffer,每个公司应该都提供双酶切使 用的buffer列表。2、鮒切后电泳条带比较好，切胶回收的效果不好.3、J'转化子.鉴定也比较 麻烦.自己都不知道连上的到底是目的片段还是非目的片断。最好用回收产物做连接。4、酶切时如果质粒很大7kb那么希望得到的600bp亮度
28、相对vector太暗可能看不到.如果600的 带看不到，可以试试加大酹切的质粒的量。相同皿1数600和彳900的带克度差别会很大。5、如果酶没有问题那就要确定双酶切是否已经切开了，已经切开了，只是600bp比较弱的话.可以尝试 加大酶切体系（如増大臨切休系为凍來的两倍或三倍）.酚切后乙醇沉淀富集酶切片断后用小体枳TE溶 解后电泳.效果可能有所改善。如果根木就没有切开的话.那就要考虑是否是酶的问题.buffer的问题或 质粒的问题°将载体和目的片段（PCR扩増产物.约500bp,两端设有酶切位点）分别用EcoRl和BamHl双曲切后，定向 连接。但载体上该双酶切位点间有一个SOObp的
29、片段，晦切后电泳可见这一片段，表明的切成功.胶回收 了大片段。连接转化成功后，挑选的収菌落提质粒.PCR鉴定表明有目的片段.约500bp.但双酶切却仍 然是SOObp的原片段长度。目的片段不含有双的切位点。请问连接是否成功？若成功为何会出现这种 奇怪的现彖？参考见解：如果pCR没有污染1、假设挑选的是取菌落则有可能是因为自己引物非特界扩増。PCR比的切更易岀问题，相信酶切结果, 没连上。2、假如PCR没有问题，最可能是菌被污染，连上但有污染。这种可能性大°假阳性产生的可能性极 大。3、报好重新挑科隆.摇菌。如果不行再用通用引物确定是否没有连上。4x应该使用栽体引物來作PCR鉴定，I大
30、1为自己的引物作很有可能出现假阳性。5、片断是5OObp的，而载体切下來的片断中含有SOObp.是否是因为重组质粒的浓度太低使得SOObp 的片断可以见到.而没有办法看见5OObp6、可以看到SOObp的片断.应该是載体自连接，因为插入片断后载体的酶切位点移位.应该没有办法再 次切下SOObp的片断.所以建议重新挑菌再作。7、如果您能通过PCR检测出您提取的质粒中含有目的片断，而双酶切时却只能駄示应该切除的片断，说明 可能出现的情况是:您的连接成功，但是您挑取的菌落并不是做克隆，而是包含有假阳性（也就是自连接的 质粒菌落）的混合菌落,而且假阳性菌落比例髙于需耍的阳性菌落，导致在进行摇菌扩増质粒
31、时，同时大虽 扩増假阳性质粒，从而出现上而描述的悄况.8、如果打算从新开始晦切，连接，转化的话，建议加大酶切时酹的使用址，在酶切片断回收时尽虽不要切 下朵带.这样可以尽量减少自连假阳性的可能性c9、如果不打算从新做过.建议在原來已经铺好细菌的LB固体培养基上，再挑収一些菌落.可以一次性 *挑几个也克隆（记住.提取试剂盒进行小虽提取并且酶切鉴定.这样可以节省大量的时间，并且取的不错的效 果.在用试剂盒提取之前每个菌落保留l、2ml菌液.冻存，并标记好对应的试管，如果之后发现那个菌落 是阳性克隆的话.回过头來就可以使用冻存的菌液大虽提取感受态保存时间不耍太长，垠好3个丿J以内，保存负70度，时间长
32、效率会降低的。如果合适.可以用蓝白筛选阳性菌落，X-GAL和IPTG是40： 7,兰色为阴性.白色阳性保存正确的温度最少是-20C, 般长期保存需嬰放宜70匕就算是-709保存，一般经过3个丿J以上后，质 粒会降解非常大在做转化之前一定是先要鉴定质粒的浓度和质虽的如果有条件可以利用仪器测试浓度， 简单的办法就是取一定虽（根据质粒浓度决定）进行电泳,然后和marker比较，來测定浓度。转化过程中的温度非常重婆，特别是QC这步，都精确到考世Ep管管壁厚薄的影响.关于只有第3次长f 1各菌落，怀疑没有转好长得朵菌。”首先，16h是不够的,最少也要观察48h, I大 为转化了质粒的细菌不比正常细菌，受了伤长得很慢而且数虽不会很女，有5、6个菌落就是非常好的现念. 就算长了一个菌落可以挑出來摇摇看，也许就是需耍的。