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1、一、实验室常见菌株简介XI1-Blue 菌株基因型：endA1 gyrA96(naIR) thi-1 recAI relAI lac glnV44 F?Tn10 proAB+ laclq (lacZ)M15 hsdR17(rK mK+)。特点：具有卡那抗性、四环素抗性和氯霉素抗性。用途：分子克隆和质粒提取。BL21(DE3)菌株基因型：F-ompT gal dcm Ion hsdSB(rB- mB-)入(DE3 lacI lacUV5T7 gene 1 ind1 sam7 nin 5)。特点：该菌株用于以T7 RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。 T7噬菌体RNA聚合酶基因的表
2、达受控于 入噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该 区整合于BL21的染色体上。该菌适合于非毒性蛋白的表达。用途：蛋白质表达。BL21(DE3)ply 菌株基因型：F- ompT gal dcm Ion hsdSB(rB- mB-)入(DE3) pLysS(cR)。特点：该菌株带有pLysS,具有氯霉素抗性。此质粒还有表达T7溶菌酶的基因， T7溶菌酶能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达。 适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。用途：蛋白质表达DH5a菌株基因型：F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG 80dlac
3、Z M15 (lacZYAargF)U169, hsdR17(rK-,入-特点：一种常用于质粒克隆的菌株。 其80dlacZ M1基因的表达产物与pUC 载体编码的伕半乳糖苷酶氨基端实现a互补，可用于蓝白斑筛选。recA1和endA1 的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。用途：分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。JM109菌株基因型：en dA1 gl nV44 thi-1 relA1 gyrA96 recA1 mcrB+ (proAB) e14-F? traD36 proAB+ lacIq lacZ M15hsdRriK+J<特点：部分抗性缺陷，适合重复基因表达，可用于M
4、13克隆序列测定和蓝白斑 筛选。用途：分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。DH10B菌株基因型：F- mcrA (mr-hsdRMS-mcrBC) 80dlacZ M15 lacX74 endA1 recA1 deoR (ara,leu)7697 araD139 galU galK n upG rpsL-入The most widely used E. coli strain for BAC cloning is DH10B。host for pUC and other -complementation vectors; pBR322useful for gen erati ng geno mic
5、 libraries containing methylated cytos ine or ade nine residues useful for plasmid rescue proceduresELECTROMAX DH10B T1 CELLS说明：DH10B细胞是高转化效率的E. coli，可以完美应用于大多数实验应用DH10B基因型具有以下特点：lacZ M15用于重组克隆的蓝/白斑筛选消除了 mcrA、mcrBC、mrr和hsdRMS限制系统，允许构建更多具有代表性的 基因组文库（1,2）endA1突变，可以增加质粒产量和数量?高效率转化大小为150 kb的质粒，用于产生cDNA或
6、基因组文库DH10B?可以表达tonA的基因型，tonA能够提供对T1和T5噬菌体感染的抗性 (DH10B? T1R)。DH10B 的基因型：F mcrA (hsraiRMS-mcrBC) © 80lacZ M15 lacX74 recA1 en dA1 araD139 (ara, leu)7697 galU galK入 rpsL (StrR) nupGDH10B T1R 的基因型：F mcrA (hsdRMS-mcrBC) © 80lacZ M15 lacX74recA1 endA1 araD139 (ara, leu)7697 ggdUK 入rpsL (StrR) nu
7、pG tonARosetta(DE3)菌株RosettaTM宿主茵是BL21情生菌.罷啊显增强带有大肠杆菌稀有常码子旳真核蛊白的責达“谨菌秣通过一亍招容怪氯宥棄抗席质粒补充密码予AU久AGG* AGA. CUA. CGCGGA的tRNAb这样Rosetla 株实现T 万魅”的制译"而一胺情况下：由于受大肠杆萌密码于使用狈率旳眠制.真核奄白憲达常有宙难MFINA茶因由它们的犬然启动于駆动、在 Rosetta (DE3) pLysS W Rosetta DE3) pLacI 中，稀有 tRNA $ 因存在于分别带有无黄口表达E. coli |KJ 咚码子fli袴性补充移有幌碍子的tRNA
8、t带持肓汽码子F谨内号疋入肠血兰窃码FRosetta 2Rosetts-g曰mi 2 RDsetta-gami B RcsettaBlue岀现戡蛊董口僦键形成因降低栖4把属封还專件：利用促富二帆謹朋战的各种ftUftSOrlgannl 2Roseita-ami £Rcsetta-gami B表达迪快.表达控制优化表达水平：降涼 沪TG敞度优比TunerRcstts-ami B蚩口无清性蚩白帽渥折叠降低和主葩血的证原性：利用促进二建弱威豹各种義体标签Origami 2Rosetta-gam i 2 RoseHs-gaml B控制优化表达水平:隆. IPTG谊嵐优化TunerRoseHs
9、iairrii B堀胞死亡，生离性蛍口更严宿的本底表达抨制pLy$S商株无丸隆生M过岛本直襄达更严格的本底震达控削pLysS> pLysE曲-株首先来一些大肠杆菌表达的基本概念：一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株，如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。选择表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法等等。主要归结在表达载体的选择上。表达载体：我们关心的质粒上的元件包括启动子，多克隆位点，终止密码，融合Tag （如果有的话），复制子，筛选标记 /报告基因等。通常，载体很贵，我们可以通过实验室
10、之间交 换得到免费的载体。但是要小心，辗转多个实验室和多个实验室成员之手的载体是否保持原 来的遗传背景？ MCS是否还是原来那个 MCS ?是我们要特别注意的。复制子：通常表达载体都会选用高拷贝的复制子。PSC101类质粒是严谨方式复制，拷贝数低，pCoEl，pMBI（pUC）类的复制子的拷贝数高达 500以上，是表达载体常用的。通常情况 下质粒拷贝数和表达量是非线性的正相关， 当然也不是越多越好， 超过细胞的承受范围反而 会损害细胞的生长。如果碰巧需要 2个质粒共转化，就要考虑复制元是否相容的问题。筛选标记和报告基因：氨苄青霉素抗性是最常见的筛选标记，卡那霉素或者是新霉素次之， 通常是另一个
11、载体的筛选标记用。四环素，红霉素和氯霉素等已经日渐式微。抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰，比如代谢研究中要留意抗性基因编码的酶是否和代谢物相互作用。在表达筛选中要注意的问题应该就是LB倒板前加抗生素的温度，温度过高容易导致抗生素失效。今天耐青霉素的超级细菌泛滥，不知道是否有我们实验人员的功劳呢？ 大家I便倒掉I已经获得氨苄抗性的大肠杆菌之前有没有经过煮沸或者消毒等处理呢？从 以前的一针50万单位到现在100多万个单位，青霉素剂量似乎越来越大了。对于做表达来说，如果不是要研究启动子的强弱，通常比较少关心或者用到报告基因吧。 绿色荧光蛋白是最常用的报告基因了（注意选择适用原核表达版本的
12、GFP）,其他还有半乳糖苷酶啊，荧光素酶啊等等。一些融合表达Tag也有报告基因的功能。启动子、终止子和核糖体结合位点启动子：启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一。从转录模式上看有组成型表达和诱导调控型表达。lac和Tac, PL和PR, T7是最常用的启动子，生物通在下面和后继的 文章中会逐一介绍组成型表达：表达载体的启动子为组成型启动子，也就是一直努力不停表达目的蛋白的启动子，如pMAL系统。持续性表达通常表达量比较高，成本低，但是不适合表达一些对宿主 细菌生长有害的蛋白。因为过量或者有害的表达产物会影响细菌的生长，反过来影响表达量的积累。诱导调控型表达：表达载体采用诱导型启动子，只
13、有在诱导剂存在的条件下才能表达目的产物。这种方法有助于避免菌体生长前期高表达对菌体生长的影响，又可减少菌体蛋白酶对目标产物的降解。特别适合解决有毒蛋白的表达。另外也有启动子是组成型的，但是启动子所依赖的转录酶是诱导表达的，也属于诱导表达系统。融合表达：表达载体的多克隆位点上有一段融合表达标签（Tag）,表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。对于特别小的分子建议用较 大的Tag（如 GST）以获得稳定表达；而一般的基因多选择小 Tag以减少对目的蛋白的影响。His-Tag是最广泛采用的 Tag。分泌表达：在起始密码和目的基因之间加入信号肽，可以引导目的蛋白穿
14、越细胞膜，避免表达产物在细胞内的过度累积而影响细胞生长，或者形成包含体，而且表达产物是可溶的活性状态不需要复性。通常这种分泌只是分泌到细胞膜和细胞壁之间的周质空间。可溶性表达：大肠杆菌表达效率很高，特别是强启动子，目的蛋白来不及折叠而形成不溶的 包含体颗粒，包含体容易纯化但是复性效率不高。分泌表达可以得到可溶的产物，也有部分融合Tag有助于提高产物的可溶性，比如Thio , pMAL系统。转录终止子对外源基因在大肠杆菌中的高效表达有重要作用一一控制转录的RNA长度提高稳定性，避免质粒上异常表达导致质粒稳定性下降。放在启动子上游的转录终止子还可以防止其他启动子的通读，降低本底。转录终止子有两类，
15、Rho因子作用下使转录终止 mRNA和根据模版上的对称序列形成发夹结构而终止mRNA。常见的是rrnB rRNA操纵子的T1T2串连转录终止子。核糖体结合位点：启动子下游从转录起始位点开始延伸的一段碱基序列，其中能与rRNA16S亚基3'端互补的SD序列对形成翻译起始复合物是必需的，多数载体启动子下游都有SD序列，也有些载体没有，适合自带 SD序列的基因表达，要留意。表达菌株：我们往往最容易忽视的一点。 不同的表达载体对应有不同的表达菌株， 一些特别 设计的菌株更有助于解决一些表达难题， 这一点生物通会有专门的介绍。 同样的，交换获得 的免费菌株，要小心其遗传背景是否已经发生改变？当心
16、。注：以上各种特性是可以相互组合的，不是排他的！几个常用的启动子和诱导调控表达系统最早应用于的表达系统是Lac乳糖操纵子，由 启动子Plac +操纵基因lacO +结构基因组成。其转录受 CAP正调控和lacI负调控。lacUV5突变能够在没有 CAP的存在下更有效地起始转录，该启动子在转录水平上只受物是一种阻遏蛋白，能结合在操纵基因以和lacI产物结合，使其构象改变离开 了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。lacI的调控，因而随后得到了更广泛采用。lacI产lacO上从而阻遏转录起始。乳糖的类似物IPTG可 lacO,从而激活转录。这种可诱导的转录调控成为tac启动子是trp启动子和lac
17、UV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI阻遏蛋白调控的强启动子特性。在常规的大 肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq突变菌株常被选为 Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。现在的 Lac/Tac/trc载体上通常还带有laclq基因，以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。 IPTG广泛用于诱导表达系统，但
18、是IPTG有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。另外一种研究方向是用lacI的温度敏感突变体，30度下抑制转录，42度开发。热诱导不用添加外来的诱导物，成本低， 但是由于发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果，而且热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活，一些蛋白酶会影响产物稳定。以入噬菌体再起转录启动子Pl、Pr构建的载体也为大家所熟悉。这两个强启动子受控于入噬菌体cI基因产物。cI基因的温度敏感突变体cl857(ts)常常被用于调控 Pl、Pr启动子的转录。同样也是30度下阻遏启动子转录，42度下解除抑制开发转录。同样的，Pl、P
19、r表达载体需要携带cI857(ts)菌株作为表达载体，现在更常见的做法是在载体上携带cI857(ts)基因，所以可以有更大的宿主选择范围。另外一种思路是通过严谨调控cI产物来间接调控Pl、Pr启动子的转录。比如Invitrogen的Pl表达系统，就是将受trp启动子严谨调控的 cI基因溶源化 到宿主菌染色体上，通过加入酪氨酸诱导抑制trp启动子，抑制cI基因的表达，从而解除强大的T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙 的设计而成为原核表达的首选，尤其以 Novagen公司的pET系统为杰出代表。强大的 T7 启动子完全专一受控于 T7 RNA聚合酶，而高
20、活性的T7 RNA聚合酶合成mRNA的速度比 大肠杆菌RNA聚合酶快5倍一一当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过T7表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的 50%以上。由于大肠杆菌本身不含T7 RNA聚合酶，需要将外源的 T7RNA聚合酶引入宿主菌，因而T7 RNA聚合酶的调控模式就决定了T7系统的调控模式非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录，从而避免目的基因毒性对宿主细胞以及质粒稳定性的影响；通过控制诱导条件控制T7 RNA聚合酶的量，就可以控制产物表达量，某些情况下可以提高产物的可溶性部分。有何高招？且看
21、生物通为你道来：有几种方案可用于调控 T7 RNA聚合酶的合成，从而调控T7表达系统。1噬菌体DE3是lambda噬菌体的衍生株，含有 lacl抑制基因和位于lacUV5启动子下的T7 RNA聚合酶基因。DE3溶源化的菌株如 BL21(DE3)就是最常用的表达菌株，构建好的表达 载体可以直接转入表达菌株中，诱导调控方式和lac一样都是IPTG诱导。2另一种策略是用不含 T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可完全避免因目的蛋白对宿主细胞的潜在毒性而造成的质粒不稳定。然后用入CE6筮菌体侵染宿主细胞 一一CE6是lambda噬菌体含温度敏感突变(cI857ts)和pL/pR启动子控制T7 R
22、NA 聚合酶的衍生株，在 热诱导条件下可以激活 T7 RNA聚合酶的合成。此了噬菌体之外，还可以通过共转化质粒提供T7 RNA聚合酶。比如有人用受溶氧浓度控制的启动子调控 T7 RNA聚合酶合成，据说这比较适合工业化发酵的条件控制。由于T7 RNA聚合酶的调控方式仍有可能有痕量的本底表达，控制基础表达的手段之一 是培养基外加葡萄糖，有助于控制本底表达水平。2是采用带有T7lac启动子的载体在紧邻T7启动子的下游有一段lacl操纵子序列编码表达lac阻遏蛋白(lacl) , lac阻遏蛋白可 以作用于宿主染色体上 T7 RNA聚合酶前的lacUV5启动子并抑制其表达，也作用于载体 T7 lac启
23、动子，以阻断任何 T7 RNA聚合酶导致的目的基因转录。pLacl工转化也是同样的原理。如果这还不够，更为严谨调控手段还有一一在宿主菌中表达另一个可以结合并抑制T7RNA聚合酶的基因一一T7融菌酶，降低本底。常用的带溶菌酶质粒有 pLysS和pLysE，相 容的ori都不会影响后继的表达质粒转化，前者表达的溶菌酶的水平要比后者低得多，对细 胞生长影响小，而 pLysE会明显降低宿主菌的生长水平，容易出现过度调节，增加蛋白表 达的滞后时间，从而降低表达水平。通过几种不同方法来巧妙调控T7聚合酶合成，T7启动子发展出了史上功能最强大，最丰富的表达系统。生物通在下面首先进行主流表达系统介绍：了解各种产品的特色，是选择合适的表达系统的关键哦。