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1、小鼠脑钠素/脑钠尿肽（BNP）酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书本试剂盒仅供体外研究使用、不用于临床诊断 !预期应用ELISA 法定量测定小鼠血清、血浆或其它相关生物液体中 BNP 含量。实验原理用纯化的 BNP 抗体包被微孔板，制成固相载体，往微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的 BNP 抗体、 HRP 标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物（ TMB ）显色。 TMB 在过氧 化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的BNP 呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（ OD 值），计算样品浓度。试剂盒组成及试剂配制1、酶标板：一块（ 96 孔）2、
2、标准品（冻干品）： 2 瓶，请临用前 15 分钟内配制。每瓶以样品稀释液稀释至 1ml，盖好后室温静置大约 10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为 1,000 pg/ml，然后做系列倍比稀释（注：不要直接在板中进行倍比稀释），分别配制成1,000 pg/ml， 500 pg/ml ，250 pg/ml， 125 pg/ml， 62.5 pg/ml， 31.2 pg/ml， 15.6 pg/ml，样品稀释液直接作为空白孔0pg/ml。如配制500 pg/ml标准品：取 0.5ml （不要少于 0.5ml ）1,000 pg/ml的上述标准品加入含有 0.5ml 样品稀释液的 Eppend
3、orf 管中，混匀即可，其余浓度以此类推。3、样品稀释液：1X 20m。4、 检测稀释液 A: 1X 10m。5、 检测稀释液 B: 1X 10m。6、 检测溶液A : 1X 120 /瓶（1:100）。临用前以检测稀释液 A 1:100稀释（如：10检测 溶液 A / 990 检测稀释液 A） ，充分混匀，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配7、检测溶液B : 1X 120/瓶（1:100）。临用前以检测稀释液B 1:100稀释。稀释方法同检测溶液 A 。8、底物溶液：1X 10ml瓶。9、 浓洗涤液：1 X 30ml瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。10、终止液：1X 10mlB（
4、2 mol/L H2SO4）。11 、覆膜： 5 张12、使用说明书： 1 份 自备物品1、酶标仪（建议仪器使用前提前预热）2、微量加液器及吸头， EP 管3、蒸馏水或去离子水，滤纸 标本的采集及保存1、 血清：全血标本请于室温放置 2小时或4过夜后于1000 g离心20分钟，取上清即可检 测，或将上清置于 -20 或-80 保存，但应避免反复冻融。2、血浆：可用 EDTA 或肝素作为抗凝剂，标本采集后 30 分钟内于 1000g 离心 15分钟， 取上清即可检测，或将上清置于 -20 或-80 保存，但应避免反复冻融。3、 其它生物标本：请1000 g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置
5、于 -20或-80保 存，但应避免反复冻融。注：以上标本均应密封保存， 4 保存应小于 1 周， -20 不应超过 1 个月， -80 不应超过 2 个 月；标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。操作步骤实验开始前，各试剂均应平衡至室温，试剂不能直接在37 溶解；试剂或样品配制时，均需充分混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进 行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。1、加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100 ，余孔分别加标准品或待测样品 100 ，注意不要有气泡，加样 时将样
6、品加于酶标板底部，尽量不触及孔 壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜， 37 温育 2 小时。为保证实验结果有效 性，每次实验请使用新的标准品溶液。2、弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A 工作液 100 （临用前配制），酶标板加上覆膜， 37 温育 1 小时。3、弃去孔内液体，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2 分钟，大约 400 /每孔，甩干（也可轻 拍将孔内液体拍干）。4、每孔加检测溶液 B 工作液（临用前配制） 100 ，加上覆膜， 37 温育 1 小时。5、弃去孔内液体，甩干，洗板 5 次，方法同步骤 3。6、每孔加底物溶液 90 ，酶标板加上覆膜 37 避光显色（反应时间控
7、制在 15-30 分钟，当 标准孔的前 3-4 孔有明显的梯度蓝色，后 3-4 孔梯度不明显时，即可终止）。7、每孔加终止溶液 50 ，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物 液的加入顺序相同。8、立即用酶标仪在 450nm 波长测量各孔的光密度（ OD 值）。注：1、试剂准备：所有试剂在使用前应平衡至室温，使用后请立即按照说明书要求保存试剂。 实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。2、加样：加样或加试剂时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导 致不同的 “预温育 ”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。一次加样时间（包 括标准品及所有样品）最
8、好控制在 10 分钟内。推荐设置复孔进行实验。3、温育： 为防止样品蒸发， 实验时将加上盖或覆膜的酶标板置于湿盒内，以避免液体蒸发洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态；同时应严格遵守给定 的温育时间和温度。4、洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中 吸水，同时要消除板底残留的液体和手指印，避免影响最后的酶标仪读数。5、试剂配制： Detection A 及 Detection B 在使用前请手甩几下或少时离心处理，以使管壁 或瓶盖的液体沉积到管底。标准品、检测溶液 A 工作液、检测溶液 B 工作液请依据所需的 量配制使用，并使用相应
9、的稀释液配制，不能混淆。请精确 配制标准品及工作液，尽量不 要微量配制（如吸取检测溶液 A 时，一次不要小于 10 ），以避免由于不准确稀 释而造成 浓度误差；请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液 A 工作液、检测溶液 B 工作液。6、反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如，每隔10 分钟），如颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。7、底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。洗板方法1、 手工洗板方法：将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml 注入孔内，浸泡 1-2 分钟，吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体，在实验台上铺垫几
10、层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次； 根据需要，重复此过程数次。2、 自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。特异性本试剂盒可同时检测重组或天然的小鼠BNP ，且与其它相关蛋白无交叉反应。计算各标准品及样本 OD 值扣除空白孔 OD 值后作图（七点图），如设置复孔，则应取其平均 值计算。以标准品的浓度为纵坐标（对数坐标）， OD 值为横坐标（对数坐标），在对数坐curve expert 1.3，根据样品标纸上绘出标准曲线。推荐使用专业制作曲线软件进行分析，如OD 值计算出标OD 值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 准曲线的回归方程式，将样品的 O
11、D 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即 为样品的实际浓度。检测范围： 15.6 pg/ml - 1,000 pg/ml ，绘制标准曲线请取用以下浓度值： 1,000 pg/ml ，500 pg/ml ，250 pg/ml ，125 pg/ml ，62.5 pg/ml ，31.2 pg/ml ，15.6 pg/ml。最低检测限： 3.9 pg/ml说明1. 在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染， 试剂避免受到微生物的污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。2. 小心吸取试剂并严格遵守给定的孵育时间和温度。请注意在吸取标本 / 标准品，酶结合 物或底物时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的 “预孵 育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。而且，洗涤不充分将影响试验结果。3试剂盒保存：部分试剂保存于 -20C，部分试剂保存于 2-8C，具体以标签上的标示为准。4. 浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。5. 刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。6. 中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。7. 所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。8. 有效期： 6 个月