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1、分子生物学实验报告题目：质粒DNA勺提取、纯化与鉴定姓名：学号： 班级：时间：一、实验目的：1. 学习并掌握凝胶电泳进行 DNA勺分离纯化的实验原理。2. 学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。3. 学习并掌握凝胶中DNA勺分离纯化方法。4. 掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。5. 掌握碱变性法提取质粒DNA勺方法。二、实验原理：1. 质粒DNA勺提取一一碱变性提取法：提取和纯化质粒DNA勺方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸 法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化饨密度梯度离心法和 Wizard法等。其中， 碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒 DNA勺提取。该方法操作简 单，易于操
2、作，一般实验室均可进行。提取质粒 DNA屯度高，可直接用于酶 切、序列测定及分析。EB-氯化饨密度梯度离心法，主要适合于相对分子质 量与染色体DN4目近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质 粒DN*为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。少量提 取质粒DN/®可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含 有RNA但不影响限制性核酸内切酶的消化、业克隆及连接反应等。碱变性法提取质粒DNA-股包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质 粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒 DNA在细菌细胞中，染色体 DNQ双螺旋结构存在，质粒 DNAW共价闭合环 状形
3、式存在。细胞破碎后，染色体 DNAW质粒DNA匀被释放出来，但两者变 性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色 体DNA®键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒 DNA勺大部分 氢键断裂，但两条互补链不完全分离。当用 pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐 溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA恢复原来的共价闭合环状超 螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体 DNM能复性，而是与不稳定的大分子 RNA蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉 淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒 DNA分离。溶于上活的质粒 DNA可 用无水乙醇
4、和盐溶液，减少 DN的子之间的同性电荷相斥力，使之凝聚而形 成沉淀。由于DN心RNA生质类似，乙醇沉淀DNA勺同时，也伴随着RNAK 淀，可利用RNase A将RNA奉解。质粒DNA容液中的RNase A以及一些可溶 性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒 DNA2. 凝胶电泳进行DN的离纯化：电泳(electrophoresis) 是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极 方向移动的现象。各种生物大分子在一定 pH条件下，可以解离成带电荷的 离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛 效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度
5、可因电离子的大小形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围广。此外，凝胶中 DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如漠化乙锭 (ethidium bromide , EB) 或SYBR Gold染色直接观察到，甚至含量少至 20pg的双链DNA紫外激发 下也能直接检测到。需要的话，这些分离的 DN燎带可以从凝胶中回收，用 于各种各样目的的实验。分子生物学中，常用的两种凝胶为琼脂糖 (agarose)和聚丙烯酰胺凝胶。 这两种凝胶能灌制成各种形
6、状、大小和孔径，也能以许多不同的构型和方位 进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶分辨率高，使用于较小分子核酸 (5 500bp)的分 离和蛋白质电泳。它的分辨率非常高，长度上相差1bp或质量上相差0.1%的DNMK可以彼此分离，这也是采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行 DNAff列分析 的分子基础。虽然它能很快地进行电泳，并能容纳较大的DNA!样量，但是与琼脂糖凝胶相比，在制备和操作上繁琐。琼脂糖是从海藻中提取的长链状 多聚物，由6-D-毗喃半乳糖与3,6-脱水-L-毗喃半乳糖组成，相对分子质 量为104-105。琼脂糖加热至90C左右，即可溶化形成活亮、透明的液体， 浇在模版上冷却后形成凝胶，其凝固点为 40-
7、45 C o琼脂糖凝胶相对于聚丙 烯酰胺凝胶分辨率低，但它的分离范围更大(50至白万bp),小片段DNA(50-20000bp)最适合在恒定轻度和方向的电场中水平方向的琼脂糖凝胶 内电泳分离。琼脂糖凝胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，测定DNA勺相对分子质量，分离经限制酶水解的 DN"段，进一步纯化DN酣。琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而带 有负电荷，在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率主要取 决于6个因素：样品DN的子的大小、DN的子的构象、琼脂糖浓度、电泳 所用电场、缓冲液和温度。三、主要仪器和材料试剂：1. 仪器和材料：恒温振荡培养箱，
8、高速冷冻离心机，旋涡振荡器，水浴锅，1.5mL离心管， 50mL离心管，不同型号的吸头，微量移液器，微波炉，电泳仪，制胶槽， 电泳槽，梳子，锥形瓶，电子天平，手套，紫外灯， Eppendorf管等。 菌体：E.coli DH5a受体菌，具有AmpS记的质粒pUC192. 实验试剂：LB培养基，抗生素(氨节背霉素)，溶液I ,溶液U,溶液m, RNase A 母液，TE缓冲液，饱和酚，氯仿/异戊醇混合液，酚/氯仿/异戊醇(PCI) 混合液，预冷无水乙醇，TAE电泳缓冲液(10X),上样缓冲液(6X), 琼脂糖，漠化乙锭(EB),DNA相对分子质量标准物 DNAMarker入/Hind m , 5
9、mol/L pH 5.2 的醋酸钠。四、实验步骤：1. 菌体培养：(1) 配制40mL液体LB培养基(加入 5就萄糖)、100mL固体LB 培养基、并准备足量的移液管、200 l微量移液器头、1000 l 微量移液器头、50mL离心管、1.5mL离心管，灭菌备用。(2) 向液体LB培养基移取32 l氨节宵霉素，混合均匀。(3) 将提前活化的E.coli DH5a受体菌，接种于液体LB培养基中。将锥形瓶放入包温震荡培养箱中，37 C , 200r/min培养12-16h2. 质粒DNA勺提取：(1) 称量50mL离心管重量 WI取30mL菌液丁已称重的 50mL离心 管中，配平后 6000r/m
10、in离心5min。(2) 弃上札向离心管中加入5mL溶液I,涡旋振荡，6000r/min 离心5min。(3) 弃上活并称重 W,求 W=WW1。(4) 按照1.0mL/100mg菌体的量加入溶液I ,充分涡旋振荡，冰浴5min,再按照2.0mL/100mg菌体的量加入溶液U,温和颠倒混匀，冰浴2min,然后再按照1.5mL/100mg菌体的量加入溶液 用，温和颠倒混匀，冰浴10min,平衡后12000r/min离心15min。(5) 取上活至新50mL离心管内，记录体积，加入两倍体积的冰乙醇，混匀后在-20 C环境下保存 30min。取出后12000r/min 离 心15min，弃上活,加入
11、5mL70知醇,12000r/min 离心5min, 弃上活，加入 5mL70知醇，12000r/min 离心5min,弃上活， 37 C 放置 5-10min。(6) 取出离心管，加入 1mLTE溶液得到粗提物，加入RNase A液, 使溶液浓度为 150 g/mL, 37 C保存60-120min。3. 质粒DNA勺纯化：(1) 取500 l粗提物丁 1.5mL离心管中，加入等体积的Tris饱和酚， 混匀，12000r/min 离心 10min。(2) 转移上活(体积V1)至新管，加入等Vi的酚：氯仿：异戊醇溶液， 混匀，12000r/min 离心 5min。(3) 转移上活(体积 V)至
12、新管，加入等 V的氯仿：异戊醇溶液，混 匀，12000r/min 离心 5min。1,、(4) 转移上清(体积V3)至新管，加入万V3的3MNaAc溶敝(pH5.2),再加入2V4 (VfV+却)的冰乙醇，混匀，-20C保存30-60min,取出后 12000r/min 离心 15min。(5) 弃上活，加入 500 p l 70%乙醇，10000r/min 离心2min,再加入 500 l 70% 乙醇，10000r/min 离心 2min, 37C保存 5-10min。(6) 取出离心管，向一只离心管中加入 25H lTE溶液，溶解沉淀后， 转移入另一只离心管中,再取25从l TE溶液加入
13、第一只离心管中, 溶解后再移入另一只离心管中，得到 50 H l纯化质粒DNA4. DNA屯度检测：(1) 取40mLTAE1X) 丁 300mL形瓶中，加入0.4g琼脂糖，放入微 波炉内使其熔化，60C时倒入准备好的制胶槽中。(2) 取5.0从l纯化DN珈入1.0从l上样缓冲液，混合，进行点样。(3) 点样完毕后，100V, 200mA条件下电泳 30min。(4) 电泳完毕后，进行 EB染色，用凝胶成像仪拍照，得到实验结 果。实验结果：凝胶成像仪拍照如下:图1 DNA纯度检测凝胶成像结果(1号泳道：DNA marker X /Hind m ; 2号泳道：超螺旋状态的pUC19质粒DNA 3
14、号泳道：线性的 pUC19质粒DNA 4号泳道：空泳道；5至9泳 道：7至11组pUC19质粒DNA羊品；10号泳道：入DNA本组点样在第9泳道，照片显示各种杂质去除得较为彻底，得到了较高 纯度的超螺旋状态的pUC1漩粒DNA六、1. 为获得高纯度的质粒DNA必须彻底去除杂蛋白、染色体 DN简日RNA在 整个质粒提取过程中出去染色体 dna的关键步骤是加入溶液n、溶液m 的变性和复性环节，应控制好变性和复性的时机。加入溶液I时，可剧烈震荡，使菌体沉淀转变成均匀的菌悬液，此时细胞尚未破裂，染色体 不会断裂；加入溶液II时，菌液变粘稠、透明，无菌块残留；加入溶液 in时，会立即出现白色沉淀。加入溶
15、液II和溶液in后，应缓慢上下颠倒 离心管数次，切忌在旋涡振荡器上剧烈振荡，否则染色体dna会断裂成小片段，不形成沉淀，而溶解在溶液中，与质粒DNA混合在一起，不利丁质粒DN砒纯。因此，操作时一定要缓慢柔和，采用上下颠倒的方法， 既要使试剂与染色体DNAfe分作用，乂不破坏染色体的结构。2. 酚具有腐蚀性，能损伤皮肤和衣物，使用时应小心。皮肤如不小心沾到 酚，应立即用碱性溶液、肥皂或大量活水冲洗。3. 为最大限度去除上活，可在倒掉部分上活后，再将离心管放入离心机稍 作离心，使残留在管壁的液体集中到离心管底部， 再用移液器移除液体。4. 注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿
16、。也 不要快速按出吸头内的样品，避免挤出的空气将样品冲出样品孔。5. 本次实验中，原应灭菌之前加入培养基内的葡萄糖由于操作疏忽而忘记 加入，随后按照老师指示配制100mL10%勺葡萄糖溶液一起灭菌，待灭菌 后再将葡萄糖溶液加入培养基中。6. 培养菌体所用的14个锥形瓶有2个锥形瓶中没有菌体生长迹象，另外有 2个锥形瓶内菌体生长较少。原因可能是接种时操作失误，例如可能是接 种环挑取菌种后离洒精灯火焰太近或者挑取菌种前没有充分冷却，也有 可能是接种时接入的菌量过少等。7. 在纯化DN此口入冰乙醇的步骤中，2只离心管在加入的DNA样品量相同的情况下，出现了从-20 C环境下取出后2只离心管内液体体积
17、相差较多的 情况，分析后发现量较少的1只离心管内加入的各种试剂的量是合适的。 可能的原因：在用移液器移取冰乙醇时下按力度太大，吸入过多液体；2只离心管分别由2名组员加液，操作上可能出现个人之间的误差。8. 本次实验得到的质粒DNA较少，最主要原因是选择了菌体生长较少的培养基，仅得到较少的粗提物，导致最终纯化得到的质粒DNA&较少。七、 附注：培养基及实验试剂配方：1. LB (Luria Broth )培养基LB液体培养基：1赚白月东(typtone ), 0.5%酵母粉(yeast extract ), 1%NaCl 用 NaO喝 pH至 7.2, 121 C灭菌 20min备用。L
18、B固体培养基：除以上LB培养基成分外，还需要添加1.5%2潮脂， 121C灭菌20min备用。LB半固体培养基：在 LB液体培养基中加入 0.75%琼脂，121C灭菌 20min备用。2. 氨节宵霉素：母液浓度为100 g/从l ,工作浓度为50100叫g/mL。3. TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0), 1mmol/L EDTA4. 氯仿/异戊醇混合液：按氯仿：异戊醇为24: 1 (V/V)的比例在氯仿中加 入异戊醇。5. 酚/氯仿/异戊醇(PCI)混合液：饱和酚：分析纯的酚溶化后经160C重蒸后，加入0.1% (V/V)的抗氧化8-羟基喳咻，再加入等体积的 0.
19、1mol/L Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液反复抽提，使之饱和，并使其pH为8.0,亦可购买商品化的饱和酚。按酚与氯仿/异戊醇为1:1的比例混合饱和酚与氯仿/异戊醇混合液，即 得酚/氯仿/异戊醇(PCI) (25:24:1 )混合液。6. 6X上样缓冲液：30听油，0.25%酚蓝(bromophenol blue, BPB , 0.25% 二甲苯割FF。7. 溶液 I: 50mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl(pH8.0) , 10mmol/L EDTA8. 溶液 U: 0.2mol/L NaOH , 1%SDS氧用前用 10mol/L NaOH 和 20%SDS 母液配制)。9. 溶液 m： 5mol/L KAc 60mL，冰醋酸 11.5mL，重蒸水 28.5mL;溶液 终浓度为：K+3mol/L , Ac-5mol/L ;10. RNase A 母液：将 RNase A 溶于含 10mmol/L Tris-HCl(pH7.5) 和 15mmol/L NaCl的溶液中，配成10mg/mL溶液，于100C加热15min , 使污染的DNase失活。冷却后用1.5mL无菌离心管分装，保存于-20 C。5