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1、临床生物化学检验常用技术,1,临床生物化学检验常用技术,第三章,临床生物化学检验常用技术,2,第一节 光谱分析技术第二节 电化学分析第三节 干化学分析技术第四节 电泳技术第五节 层析技术第六节 离心技术第七节 自动生化分析技术,本章内容概要,临床生物化学检验常用技术,3,教学目标和要求,1、掌握分光光度技术的基本原理及定性和定量方法。掌握电化学分析方法基本原理,2、熟悉分光光度计的基本结构和操作方法光源检查和波长校正、原子分光光度计的类型和影响荧光分析的因素。熟悉离子选择电极分类，离子选择电极的分析方法,3、了解其他光谱分析技术的基本原理及在生化检验中的应用。,临床生物化学检验常用技术,4,第
2、一节 光谱分析技术,分光光度技术的基本原理,分光光度计的基本结构,分光光度计的操作方法,分光光度技术的定性和定量方法,临床生物化学检验常用技术,5,一、光谱分析技术的基本原理：,利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特征，以此来确定物质性质、结构或含量。,1、 光谱分析技术分类：,发射光谱分析技术：火焰光度法、原子发射光谱法和荧光光谱法,吸收光谱分析技术：紫外、可见光分光光度法，原子吸收分光光度法和红外光谱法,散射光谱分析技术：比浊法,临床生物化学检验常用技术,6,微粒性(E=hv) 波粒二象性波动性(=c/v)E=hv =hc/ -光的能量与光的波长成反比，与光的频率成正比,2、光
3、的基本性质-高速传播的电磁波,临床生物化学检验常用技术,7,3、物质对光吸收的基本原理：,能量转移 -当光辐射通过某种物质时，组成该物质的分子（原子）与光子发生“碰撞”，光子的能量因此转移至分子（原子）上，使它们由基态(低能态)跃迁到激发态(高能态)，这种跃迁称为激发。,临床生物化学检验常用技术,8,选择吸收 -组成物质的分子仅吸收与其内能变化(基态与激发态能量差)相对应的波长或频率的光，所得到的光谱称为吸收光谱。,临床生物化学检验常用技术,9,能量释放 -处于较高能态的分子(激发态分子)不稳定，当其返回基态时，以热或发射光谱的形式将能量释放出来。所发射出的相应光谱，称分子发射光谱。,临床生物
4、化学检验常用技术,10,E1,E0,吸收光谱,发射光谱,激发态,基态,E1 E0,临床生物化学检验常用技术,11,（1）根据产生光谱的物质结构 原子光谱 (atomic spectrum) 分子光谱 (molecular spectrum),4. 分类,临床生物化学检验常用技术,12,（2）根据光谱获得的方式不同 吸收光谱（Absorption spectrum）分析法： 根据溶液能吸收由光源发出的某些波长的光后所形成的特征光谱来鉴定该物质的性质和含量的方法。 紫外-可见分光光度法 (ultraviolet and visible spectrophotometry) 原子吸收光谱法 (ato
5、mic absorption spectrophotometry) 红外光谱法 (infrared spectrometry),临床生物化学检验常用技术,13, 发射光谱(emission spectrum)分析法： 根据物质受到热能或电能等的激发后所发射出的特征光谱来进行定性及定量分析的一种方法。 原子发射光谱法 (atomic emission photometry) 分子发光分析法,临床生物化学检验常用技术,14,1、定义： 根据被测物质对各种不同波长光的吸收能力，绘制吸收曲线，并根据曲线的特性鉴定物质的方法。 属光谱分析法。,二 分光光度法,临床生物化学检验常用技术,15,可见光： 4
6、00700nm,有色物质溶液 紫外光： 200400nm,无色物质,临床生物化学检验常用技术,16,2、特点： 仪器设备和操作简单 费用少，分析速度快 灵敏度高(10-410-7g/mL) 选择性好 精确度和准确度高,临床生物化学检验常用技术,17,3、应用：,（1）定性分析 定性鉴定 纯度鉴定 结构分析,（2）定量分析,临床生物化学检验常用技术,18,（一）光吸收的基本定律 1、定律： 单色光通过吸光溶液后，吸光度与溶液的浓度和厚度之间呈正比关系。,临床生物化学检验常用技术,19,（1）Lambert定律： 说明吸收与溶液液层厚度间的关系,L1,L2,入射光,透过光,入射光,透过光,L2 L
7、1 ，I1 I2,I0,I1,I0,I2,临床生物化学检验常用技术,20,（2）Beer定律： 说明吸收与溶液浓度间的关系,临床生物化学检验常用技术,21,2、表达式： -lgI/Io=-lgT=KLC A=- lgT=KLC I/Io为透光率(Transmittance, T) A为吸光度(Absorbance) K为吸光系数(absorptivity) L为液层厚度 C为溶液浓度(concentration),摩尔吸光系数：当溶液层厚度单位为cm，浓度单位为mol/L时，K即成为摩尔吸光系数,临床生物化学检验常用技术,22,光源,单色器,样品室,检测器,显示,1. 光源 在整个紫外光区或可
8、见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。,可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在3202500 nm。 紫外区：氢、氘灯。发射185400 nm的连续光谱。,（二）分光光度计的基本结构,临床生物化学检验常用技术,23,2.单色器,将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。 入射狭缝：光源的光由此进入单色器； 准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束； 色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；,聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝； 出射狭缝。,临床生物化学检验常用技术,24,3. 样品室,样品室放置各
9、种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。4. 检测器 利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。,5. 结果显示记录系统 检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理,临床生物化学检验常用技术,25,（三）分光光度计的类型,1.单光束 简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。,2.双光束 自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。,临
10、床生物化学检验常用技术,26,3.双波长,将不同波长的两束单色光(1、2) 快束交替通过同一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。=12nm。两波长同时扫描即可获得导数光谱。,临床生物化学检验常用技术,27,仪器,可见分光光度计,临床生物化学检验常用技术,28,仪器,紫外-可见分光光度计,临床生物化学检验常用技术,29,Beckman 紫外-可见分光光度计,eppendorf 紫外-可见分光光度计,临床生物化学检验常用技术,30,（四）分光光度计的操作方法,A. 分光光度计的基本操作,以721-A型分光光度计为例，其基本的操作步骤为：,1.开721-A分光光度计的开关，将比色池的盖子
11、打开，通电20分钟使仪器预热。2.将波长旋至测定的波长。3.将空白液、校准液或待测液放入比色池，将空白液置于光路中。4.将开关置于T位，打开比色池盖子，用光量粗调和光量细调调节T为0.0,关上比色池盖子，调节T为100.0。5.将开关置于A，用消光调零调节A为0.06.重复步骤4和57.将校准液或待测液推入光路，测量溶液的吸光度（A）,临床生物化学检验常用技术,31,B. 吸光度的校正,铬酸钾的标准液可用于校正分光光度计的吸光度。在25，将4mg铬酸钾溶于100ml的0.05mol/L KOH中，放入比色池中，在不同波长下测定吸光度值，与己知的标准吸光度校正表进行比较，可检测仪器吸光度的准确度
12、。,临床生物化学检验常用技术,32,使用图示,1.开启电源，指示灯亮，仪器预热10分钟，选择开关置于“T” 。,2.打开试样室盖（光门自动关闭），调节“0%T”旋钮，使数字显示为“00.0”。,临床生物化学检验常用技术,33,3.将装有溶液的比色皿放置比色架中。,4.旋动波长手轮，把测试所需的波长调节至刻度线处。,临床生物化学检验常用技术,34,5.盖上样品室盖，将参比溶液比色皿置于光路，调节透过率“100%T”旋钮，使数字显示为“100.0T”（如果显示不到100%T，则可适当增加灵敏度的档数，同时应重复“2”，调整仪器的“00.0”）。,临床生物化学检验常用技术,35,6.将参比溶液比色皿
13、置于光路中，将选择开关置于A，旋动吸光度调零旋钮，使得数字显示为.000，然后移入被测溶液，显示值即为试样的吸光度A值。,临床生物化学检验常用技术,36,8全部测定结束后，取出比色皿(洗净)，关闭开关.,临床生物化学检验常用技术,37,三、分光光度技术的定性和定量方法,（一）分光光度技术的定性方法,定性依据：,最大吸收波长max和摩尔吸光系数,2.摩尔吸光系数方法,1.最大吸收波长max方法,临床生物化学检验常用技术,38,（二）分光光度技术的定量方法,1.标准曲线法,将一系列浓度不同的标准溶液按照一定操作过程显色后，分别测吸光度(A)，以A为纵坐标，浓度为横坐标制标准曲线(至少要5点)。在相
14、同条件下处理待测物质并测定其吸光度，即可从标准曲线找出相对应的浓度,方法：,临床生物化学检验常用技术,39,AX,CX,A（吸光度）,C（浓度）,临床生物化学检验常用技术,40,制作和应用标准曲线时应注意下面几点：,（1）测定条件发生变化时（如更换标准品和试剂等），应 重新绘制。,（2）标准品应有高的纯度，标准液的配制应准确。,（3）当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再 测定。,（4）标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致。,临床生物化学检验常用技术,41,2比较法,CX=(AXCs)/As,己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白，同时测定标准管和标本的吸光度，根据
15、测定的吸光度及标准品浓度，可直接计算出标本的浓度，计算公式为：,其中Cx和Ax为标本管浓度和吸光度，Cs和As分别为标准管浓度和吸光度。用标准品法定量时，标准品的浓度应尽量和标本管浓度相近。,临床生物化学检验常用技术,42,3其它分析方法,包括差示法、多组份混合物分析和利用摩尔吸光系数分析等方法。,临床生物化学检验常用技术,43,四、其它光谱分析技术,（一）火焰光度法,（二）原子吸收分光光度法,（三）荧光光度分析法,1基本原理 2组成,1基本原理 2组成 3原子吸收分光光度法的特点,3荧光光度定量分析法 4 荧光光度分析技术的应用,1基本原理 2影响荧光强度的因素,临床生物化学检验常用技术,4
16、4,火焰光度法等离子体发射光谱法,临床生物化学检验常用技术,45,原子吸收分光光度法,临床生物化学检验常用技术,46,荧光光度法,NanoDrop ND-3300 Fluorospectrometer,临床生物化学检验常用技术,47,第二节 电化学分析,电化学分析方法基本原理,离子选择电极分类,离子选择电极的分析方法,临床生物化学检验常用技术,48,电化学分析是利用物质的电化学性质，测定化学电池电位、电流或电量的变化进行分析的方法。,电化学分析方法,电位分析法：测定原电池电动势以求物质含量的分析方法,电导法：通过电阻测定以求物质含量的分析方法,电容量分析法：借助某些物理量的突变作为分析重点的指
17、示,临床生物化学检验常用技术,49,电位分析法是利用电极电位和浓度之间的关系来确定物质含量的分析方法。,一、电化学分析方法基本原理,原电池是利用两个电极之间金属性的不同,产生电势差,从而使电子的流动,产生电流.又称非蓄电池，是电化电池的一种。,临床生物化学检验常用技术,50,电池电动势和电极电势电池电动势：将电位差计接在电池的两个电极之间而直接测得的电势值习惯上称之为电池的电动势电极电势：当采用相对电势法时，系用一定的参比电极与研究电极组成电池， 这一电池的电动势称为相对于给定参比电极而确定的研究电极电势。(金属和溶液相接触的内电位差即为金属电极和溶液间的电极电势),所谓“电极/溶液”之间的绝
18、对电势不但无法直接测量，在处理电极过程动力学问题时也不需要用到它。在计算电池电动势时， 也完全可以采用相对电极电势来代替绝对电极电势。,临床生物化学检验常用技术,51,The absolute potential differenceacross a single electrified interface cannot be measured!It is not necessary to know exact value of it but the difference of absolute potential difference isimportant for electrochemi
19、sts!,单个界面上的绝对电位是不可测的，对于电化学研究重要的是其差值,临床生物化学检验常用技术,52,参比电极顾名思义，参比电极是给出一个固定的值，其它的电极电势的测量以此为基础。一个好的参比电极应该不受温度、时间和通过小电流而变化, 应遵守Nernst 方程。指示电极指示电极的电位随离子浓度而变化，能指示待测离子浓度。,临床生物化学检验常用技术,53,二 离子选择性电极,1、定义：离子选择性电极是一种以电位法测定某些特定离子活度的指示电极。 2、特点：电极的关键部件敏感膜对溶液中特定离子有选择性响应。敏感膜并不给出或得到电子，而是选择性地让某些离子渗透，同时包含离子交换过程3、测定原理：基
20、于内部溶液与外部溶液之间产生的电位差，即膜内外被测离子活度的不同而产生电位差，称之为膜电位。,临床生物化学检验常用技术,54,临床生物化学检验常用技术,55,4、离子选择性电极分类,按国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）建议分类,临床生物化学检验常用技术,56,5、离子选择性电极的基本构造,膜电极的构成1、电极杆 （玻璃或塑料管）2、内参比电极 （银氯化银）3、内参比溶液4、敏感膜 （关键部件）,临床生物化学检验常用技术,57,（一）非晶膜电极玻璃电极,内参比电极：AgAgCl电极。玻璃泡：敏感膜内参比溶液： pH一定的缓冲溶液。,1 玻璃电极的结构,三 常用的离子选择性电极,临床生物化学检
21、验常用技术,58,（2）玻璃电极及膜电位： 玻璃电极是最早使用的离子选择性电极。 玻璃薄膜是决定电极性能的最重要组成部份。 内参比电极的电位是恒定的，与被测溶液的PH无关。 玻璃电极用作测PH的指示电极，是因为跨越玻璃膜产生了膜电位。膜电位与待测溶液PH值有关。,临床生物化学检验常用技术,59,在任意温度T下：,根据此公式，通过测定玻璃电极的电极电位，可求出膜外试液的H+活度。这是使用玻璃电极测量pH的理论根据和基本计算关系。,临床生物化学检验常用技术,60,3.玻璃电极的优点,选择性高 ：膜电位的产生不是电子的得失。其它离子不能进入敏感膜产生交换。当溶液中Na+浓度比H+浓度高1015倍时，
22、两者才产生相同的电位； 不受溶液中氧化剂、还原剂、颜色、沉淀及胶体、杂质的影响，不易中毒； 改变玻璃膜的组成，可制成对其它阳离子响应的玻璃膜电极。,临床生物化学检验常用技术,61,（二）气敏电极,气敏电极端部装有透气膜，气体可通过它进人管内。管内插入pH玻璃复合电极，复合电极是将外多比电极（AgAgCI）绕在电极周围。管中充有电解液，也称中介液。试样中的气体通过透气膜进入中介液，引起电解液中离子活度的变化，这种变化由复合电极进行检测。 如 CO2气敏电极，用 PH玻璃电极作为指示电极，中介液为0.01mol/L的碳酸氢钠。二氧化碳与水作用生成碳酸，从而影响碳酸氢钠的电离平衡来指示CO2 。,临
23、床生物化学检验常用技术,62,该类电极其实是一种复合电极：将 pH 玻璃电极和指示电极插入中介液中，待测气体通过气体渗透膜与中介液反应，并改变其 pH 值，从而可测得诸如CO2(中介液为NaHCO3)或NH4+(中介液为NH4Cl)的浓度。,气敏电极,临床生物化学检验常用技术,63,（三）生物电极 有酶电极或生物组织电极等。将生物化学与电化学结合而研制的电极。酶电极：覆盖于电极表面酶活性物质(起催化作用)与待测物反应生成可被电极响应的物质，如脲的测定氨基酸测定,临床生物化学检验常用技术,64,上述反应产生的NH4+可由铵离子电极测定。生物组织电极：由于生物组织中存在某种酶，因此可将一些生物组织
24、紧贴于电极上，构成同酶电极类似的电极。,临床生物化学检验常用技术,65,四、分析方法,（一） 标准曲线法,配制一系列已知活（浓）度的欲测离子的标准溶液，逐一插入离子选择性电极和参比电极，测出它们相应的E值，以E对C作图得标准曲线。在同样条件下测出未知溶液的E值，即可从标准曲线上查出对应的欲测溶液的离子活（浓）度。,临床生物化学检验常用技术,66,（二） 标准加入法,当待测溶液的成份比较复杂，离子强度比较大时，难以配制与待测溶液组成相近的标液，此时，采用标准加入法较适宜。,临床生物化学检验常用技术,67,（三）、仪器直读法 该法是能在离子计上直接读出被测离子的浓度，这种仪器称为专用离子计。例如：PH计、氟离子计等。,临床生物化学检验常用技术,68,五、电解质分析法在临床检验中的应用,（一） 单一型电解质分析仪,临床生物化学检验常用技术,69,四、电解质分析法在临床检验中的应用,（二） 组合型电解质分析仪,临床生物化学检验常用技术,70,四、电解质分析法在临床检验中的应用,（三） 全自动生化分析仪,