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1、1. 影响微生物生长的内在因素,H水分活度,微生物耐渗透压原理,在细胞体内积累合适的溶质(盐、多元醇和AA)至一定的浓度，从而防止细胞脱水，甚至从环境中吸收水分。G-：Pro嗜盐细菌：KCl耐盐和耐旱真菌：甘油等多元醇单核细胞增生李斯特菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌：Gly和甜菜碱,Salt Stress Proteins Induced in Listeria monocytogenes,存活的环境很广：渗透压：10% NaClT：0.1 45pH：在pH5.5调节后可低至 3.5 经常从高盐制品中分离得到，如烟薰鲑鱼。甚至在22放置150天的纯盐中还能检测出来。,Salt Stress Prot
2、eins Induced in Listeria monocytogenes,当细菌生存的环境中一些影响生长或存活的参数发生改变后，会启动新的基因表达程序，一些蛋白的表达量会增加或降低以应对环境压力。 2-D gel：在盐压力下有40个蛋白/400-500个的表达被明显诱导或抑制。12个与普通应力蛋白(Ctc和 DnaK)、转运子(GbuA和甘露糖特异的磷酸转移酶IIAB)和普通代谢蛋白(丙氨酸脱氢酶等)相似的蛋白被高诱导表达。,APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 2002, 68(4):14911498,3) 氧化还原电位(Eh),当电子从一个化合
3、物转移到另一个化合物时，两物质间就产生电势差。物质被氧化得越多，Eh越高，当氧化物和还原物浓度相等时，电势为零。分子态氧影响基质的氧化还原状态。好氧微生物需要正的Eh (被氧化)，其生长繁殖能降低环境中的Eh。食品中有利于维持还原条件的物质：肉中SH基、VC，果蔬中的还原糖等。,食品的Eh和微生物繁殖,4) 营养成分,微生物生长需要的营养物质：水、能源、氮源、维生素及相关的生长因子、矿物质微生物对营养物质的利用简单化合物（AA、单糖等）、大分子（多肽、简单多糖等）、复杂化合物（蛋白质、淀粉、纤维素、油脂）,先简单，后复杂（二次生长现象）,二次生长现象,微生物的分解能力,5) 抗微生物成分,具有
4、抗微生物成分的食品，有较强的抗菌能力部分食品含有具抗菌能力的油鸡蛋、牛乳中的溶菌酶乳免疫球蛋白IgG（牛）、IgA（人）、IgD、IgE、IgM）乳过氧化物酶/SCN-/H2O2体系抑制期乳链球菌期乳酸杆菌期真菌期胨化菌期外源性的抗微生物成分生物杀菌剂、化学杀菌剂,A.S. Naidu, Natural Food Antimicrobial Systems, 2000, CRC Press.,6) 生物结构,天然食品自身的外层结构种子的种皮水果的外皮坚果的壳动物的皮毛蛋壳加工食品的外包装有类似作用肠衣、包装袋、瓶罐,2.影响微生物生长的外在因素,贮藏温度环境中的气体以及其浓度环境的相对湿度其他
5、微生物的存在及其活性,温度微生物的生长温度范围,太平洋深海热泉的过热水流中寻找到铁代谢细菌，在121能生长，在130能存活,微生物生长速度与温度的关系,温度系数Q10=V(t+10)/Vt =1.5-2.5同一微生物在不同温度下增代时间不同不同微生物在最适温度下增代时间不同,影响微生物对热抵抗力的因素,菌种 菌龄个体数量基质含水量、营养成分、盐类、pH、抑制性物质加热温度和时间,高温对微生物的影响,菌体蛋白质、核酸、酶系统等生物高分子的氢键受到破坏菌体蛋白质变性核酸发生降解变性失活破坏细胞的组成热溶解细胞膜上类脂质成分形成极小的孔，使细胞内容物泄漏,嗜热微生物耐高温原因,耐高温酶：嗜热脂肪芽孢
6、杆菌-淀粉酶，呼吸链蛋白质的热稳性高。特殊的DNA构成和结构G+C含量高核苷酸排列非常有序嗜温菌的DNA螺距短tRNA：增加G+ C含量，加入硫原子膜脂的特殊结构：细胞膜中UFA含量降低，SFA含量增加特殊因子：多聚胺、Ca2+,嗜热菌的生长曲线,低温对微生物的影响,降低代谢速率，抑制菌体生长，导致敏感菌的死亡冰冻对微生物的影响物理效应：冰晶刺伤 化学效应：脱水,冷冻对微生物的杀灭作用,冷休克指生长在适宜温度下的G-嗜温菌活菌体在温度骤然下降时发生的大量菌体细胞死亡的现象。原因：急冷使膜脂质“冻结”，在细胞膜上形成致命的“小孔”，常伴随着低分子量细胞组分的释放。刚好在冰点以下，尤其在-2时死亡
7、速率相对最快；冷冻后存活的微生物在冷冻状态下会逐渐死亡。低温对芽孢和微生物毒素几乎没有作用。,影响冰冻对微生物作用的因素,冷冻方式和温度速冻20/30min缓冻372h冷休克微生物特性 冷冻基质,嗜冷菌,定义：在-1020能够生长，最适生长温度在1015的微生物。专性嗜冷菌(Psychrophile)最适15或更低，最高为20，最低0 兼性嗜冷菌(适冷菌, Psychrotroph) 在5或更低温度下可生长，但最适温度却在2530的微生物。,嗜冷菌低温生长的机理,有较低的代谢速率。细胞膜UFA含量较高，或脂肪链变短(嗜冷小球菌)，使膜有较高的流动性，有利于低温下膜上物质的输送。最高生长温度与热
8、敏感的呼吸酶系有关。,2) 环境中的气体以及其浓度,1) O2好氧性微生物大多数细菌、所有放线菌和霉菌。厌氧性微生物O2存在时，形成的H2O2无法分解，反而对它有毒性作用。兼性厌氧微生物 有O2存在时，进行有氧呼吸；无氧时，进行无氧呼吸或发酵。,环境中的气体以及其浓度,2) CO2含量稍高于正常含量：促进生长。高浓度：抑制需氧性细菌和霉菌生长，但酵母和乳酸菌的耐受力强。3) N2对霉菌的生长和产毒素有抑制作用。4) O3除芽孢外，对各种微生物细胞有强烈杀菌作用，已广泛用于果品的保鲜贮藏。,混合气体保鲜,气调贮藏抑制苹果、梨等水果的真菌性腐烂。鲜肉的充气包装O2:N2:CO2 7:2:1 O2:
9、CO2 75:25鱼类气调贮藏CO2 80% + 空气,3) 相对湿度,干燥食品：防潮失水：品质变差,4) 生物因素(1),1)拮抗（Antagonism)常见拮抗作用：乳酸、抗菌素、pH抑制、有机酸、H2O2、双乙酰拮抗机理对营养物的竞争吸附或附着位点的竞争提供不良环境产生抗菌素产生拮抗作用的微生物要求,生物因素(2),2)互生共培养技术，活菌制剂3)共生根瘤菌、地衣4)寄生噬菌体、病原微生物,3. 栅栏技术,栅栏技术 (Hurdle Technology) ：在食品设计和加工过程中，利用食品内部能阻止微生物生长繁殖的因素间的协同作用，控制食品安全性的综合性技术措施。 栅栏因子 (hurdl
10、e factors): 阻止食品内微生物生长繁殖的因素。 内在的栅栏因子：pH、 Aw 、Eh外在的栅栏因子：温度 (热加工 ，低温保藏)、防腐剂 (Pres，如NaCl，NaNO2 等)、竞争性菌群 (乳酸菌)、高压、辐照、 气调或真空包装等。,Aw与其他因子间的关系,温度：在最适温度下，微生物生长的Aw最广；若降低温度，最低Aw会有所提高；营养：能拓宽微生物生长的Aw范围；pH、Eh不合适时，微生物生长的最低Aw会有所提高。供氧：好氧菌在有氧时最低生长的Aw较低，厌氧菌反之。,Effect of oxygen availability on heat, acid, salt and hyd
11、rogen peroxide stress survival of B. cereus,Aerobically grown and exposed cultures,Cultures grown microaerobically,Anaerobically,The cells grown and exposed microaerobically and anaerobically were more resistant to heat and acid than cells that were cultured and exposed aerobically.,International Jo
12、urnal of Food Microbiology 135 (2009) 303311,Effect of oxygen availability on heat, acid, salt and hydrogen peroxide stress survival of B. cereus,International Journal of Food Microbiology 135 (2009) 303311,Aerobically grown and exposed cultures,Cultures grown microaerobically,Anaerobically,各因素相互间存在
13、影响,栅栏技术原理,栅栏效应(魔方原理)：栅栏因子间的相互作用及与食品中微生物相互作用的结果，不仅仅是这些因子单独效应的简单叠加，而是相乘作用。天平原理：对于某一个单独的栅栏因子来说，其作用强度的轻微增加即可对食品的货架寿命产生显著的影响。,14065亿吨,发酵香肠中栅栏因子交互作用顺序,绞肉 斩拌 灌肠接种霉菌或酵母菌发酵干燥/成熟包装特点：最终产品通常在常温下贮存、运输，并且不经过熟制 处理直接食用,非制冷可贮高水分扇贝调味干制品,1.加入有机酸(pH6.0) 2.加热杀菌(80-90 ，30-40min) 3.真空包装 4.水分(45%)：相当于AW 0.9,作 业,在影响微生物生长的各
14、因素中，你认为哪两个因素最重要。根据这两个因素的影响机制，阐述应采取些什么措施来控制食品微生物的生长，并请举例说明。上交日期：9月27日。,4. 微生物环境响应的机制,一般机制特殊机制,Ahmed E. Yousef, Vijay K. Juneja Microbial Stress Adaptation and Food Safety, 2003 by CRC Press,1) General stress responses of bacteria,Mechanism of Stress and Adaptive Response,Response of microorganisms to
15、 stress includes immediate emergency responses (e.g., those produced in response to shock) and longer-term adaptation. 应激响应和长期适应Stress adaptation is a complex phenomenon that differs depending on the type of stress and the bacterial species., Signal transduction,Bacterial sensing of environmental ch
16、anges is not well understood. Some stresses may affect folding of mRNA or change a proteins half-life, resulting in changes in gene expression. Other stresses may affect protein structure.In addition, changes in the membrane structure or fluidity may trigger a signal to synthesize proteins to counte
17、ract a stress.,Two-component signal transduction systems,这一系统已经证明与一些压力的感受和响应有关。 A membrane-associated sensor kinase 与膜有关的感受器激酶An intracellular response regulator 胞内反应调节器 A two-component system of Bacillus subtilis, which is involved in expression of cold-inducible genes. A membrane-bound histidine k
18、inase (DesK) that may sense changes in membrane fluidity transduces the signal to a response regulator (DesR) that putatively activates the transcription of fatty acid desaturase gene, des (Sakamoto and Murata, 2002).,53为肿瘤抑制蛋白 (简称p53蛋白或p53肿瘤蛋白)， 能调节细胞周期和抑制肿瘤，避免癌症发生，被称为基因组守护者。p53蛋白借由许多不同的压力形式而激发其活性；
19、在受到压力的细胞中，p53蛋白的半衰期会突然的增加，造成p53蛋白在细胞中的累积。其次是构型变化 (conformational change)使得p53蛋白被激发成为转录调节因子。, Transcriptional control mechanisms,Control may occur at the transcriptional or translational levels or by adjusting the stability of the mRNA or protein.One type of transcriptional control employs alternativ
20、e sigma factors. 可选择性因子Under non-stress conditions the constitutive sigma factor (70 in E. coli and A in B. subtilis) directs expression of “housekeeping” genes. Binding of an alternative sigma subunit to the RNA polymerase core enzyme changes its specificity, directing it to transcribe a different
21、group of genes and operons.,Transcriptional control mechanisms,Several stress-related regulons (coordinately regulated operons) are positively controlled by the synthesis of an alternative sigma factor.The presence of active S causes transcription of genes involved in the general stress response and
22、 stationary phase in E. coli and other Gram-negative bacteria. The similar factor in B. subtilis and other Gram-positive bacteria isB.,Transcriptional control mechanisms,Anti-sigma factors bind to a specific sigma factor forming a complex that prevents the sigma factor from binding to the RNA polyme
23、rase core enzyme. RNA聚合酶的核心酶 A stress sensor may trigger release of the sigma factor from the anti-sigma factor complex, resulting in transcription of stress related genes.,Transcriptional control mechanisms,In E. coli, the RssB protein has anti-sigma factor properties; it inhibits the expression of
24、 S-dependent genes in the presence of high S levels.B, required for general stress response in B. subtilis, is bound by an anti-sigma factor. An anti-antisigma factor is present in a phosphorylated form 磷酸化形式in the absence of stress. Stress increases the level of non-phosphorylated anti-anti-sigma f
25、actor, which is then able to bind to the anti-sigma factor, releasing B.,Transcriptional control mechanisms,Other transcriptional control mechanisms utilize repressor proteins that bind to the promoter region of a specific gene or operon, preventing transcription until conditions are appropriate, at
26、 which time the repressor protein is released from the DNA allowing transcription to proceed. The heat stress operons, dnaK and groE, are controlled in this manner in B. subtilis. They are under the negative regulation by the HrcA repressor protein binding to the CIRCE (controlling inverted repeat o
27、f chaperone expression) operator.,General stress responses of bacteria,因子：与压力抵抗有关的一族转录因子，是聚合酶的一个亚基，因在启动子识别上有重要作用，对起始转录是必要的。 细胞中有多个因子，一些特殊基因/操纵子的转录需要其中的某个因子 。如枯草芽孢杆菌中的B调节子包括20个开放阅读框(占基因组的5%)，其产物为细胞提供抵抗压力的能力(Stress responses )。,B调节子,B调节多种G+菌的压力反应，包括枯草芽孢杆菌和一些食源性病原菌如蜡状芽孢杆菌、单核增生李斯特菌和金黄色葡蔔球菌。在这些细菌中，B导致生长细
28、胞的抵抗压力基因的转录。近来发现，B同样对抗生素耐药、致病和细胞分化(如菌膜、芽孢形成和发芽)等方面也有重要作用。尽管不同的菌在B的调节和调控基因方面各不相同，但也有些规律可循。,Current Opinion in Biotechnology 2005, 16:218224,The protein products encoded by the members of the B regulon confer stress protection to the cell,Current Opinion in Biotechnology 2005, 16:218224,The regulation
29、 of B activity,Current Opinion in Biotechnology 2005, 16:218224,Cognate anti-sigma factor,B associated with core RNA polymerase, to the transcription of the B regulon,RsbU in B. subtilis has an N-terminal domain that can associate with another regulator, RsbT.,RsbP is only present in B. subtilis, an
30、d is activated upon energy stress and has a C-terminal PAS domain,RsbU can relay both environmental and energy stress signals,All these phosphatases have a C-terminal PP2C phosphatasedomain, but there is variation in the N-terminal part of the protein.,Schematic overview of B -regulated genes,Curren
31、t Opinion in Biotechnology 2005, 16:218224,anti-antisigma factor,RsbP is activated by RsbQdephosphorylate RsbVand allow it to bind RsbW,RsbX: remove phosphoryl groups from the stressosome and to mediate the duration of the stress response by resetting the system.,positive regulators,negative regulators,Antisigma factor,Current Opinion in Structural Biology 2007, 17:755760,The B cascade of Bacillus subtilis,Science 3 Oct. 2008 322: 92-96,