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1、纤维素柱的制备及其在超氧化歧化酶提纯中的应用武余波 王晓东（武汉大学 化学与分子科学学院 应用化学教改班 ）摘要： 本实验以纤维素铜氨溶液制得高分子的分级、尺寸排除色谱的纤维素填料，用梯度洗脱法分离经过离心的从猪血中提取的超氧化歧化酶，并在处用紫外吸收法测定吸光度绘制淋洗曲线。要说明实验结果关键词 ：纤维素 超氧化歧化酶 部分收集 梯度洗脱关键词不具有代表性一、前言 高分子与小分子的一个显著的区别在于其性质与其分子量密切相关。在生物高分子的研究中需要对生物大分子进行分级。但是，传统的有机沉淀剂的使用会导致生物大分子的变性失去活性，尺寸排斥色谱可以避免上述的问题，因而在生物大分子的研究中得到了广
2、泛应用。 尺寸排斥色谱的基本原理是基于高分子的分子量不同而得到分离的。当高分子流过孔径具有一定尺寸分布的色谱柱填料时，分子量小的高分子由于尺寸小进入空隙的几率较大，运动的路径较长，其保留时间较长，较晚流出色谱柱，从而达到分离的目的。 常用的分级填料是交联葡聚糖凝胶，琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶，但价格昂贵，难于大规模应用。利用来源丰富的纤维素置备色谱柱填料不仅价格低廉而且节约石油资源保护环境。尽管使用纤维素作为原料已制备了强度高，尺寸稳定性好，分辨率高的SEC填料；但由于孔径太窄，分级范围很窄，应用受到很大的限制。通过最新的研究发现，使用聚乙二醇和纤维素铜氨溶液共混可以得到孔径合适的填料，本文通
3、过对这种新型填料在超氧歧化酶分离中的应用表征了填料的性能。 超氧化物歧化酶（SOD）广泛存在于生物体中，按照其所含有的金属离子的不同分为：铜锌超氧化物歧化酶（Cu·Zn- SOD），锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)，铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD)。其催化反应如下： 2O2 -+2H+H2O2+O2 在生物体内，它是一种重要的自由基清除剂，能专一的清除O2-，保护细胞，能治疗多种疾病，并能抗衰老，对生物体有保护作用。 在猪血液中，Cu·Zn- SOD与血红蛋白等共存于红血球中。当红血球破裂后，用氯仿-乙醇处理溶血液，使血红蛋白沉淀，Cu·Zn- SOD则留在水-乙
4、醇溶液中。将磷酸氢二钾加入水-乙醇溶液中时，由于其极易溶于水中，而在乙醇中的溶解度很小，溶液明显分层，上层是具有Cu·Zn- SOD的含水乙醇相，下层是磷酸氢二钾的水相。分液后向上层含Cu·Zn- SOD的水-乙醇相中加入丙酮使SOD沉淀。极性有机溶剂能使蛋白质脱去水化层，并降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒凝聚而沉淀。将所得的蛋白质在PH=7.6磷酸缓冲溶液中，用尺寸排斥色谱柱进行纯化。二、试剂与仪器21. 试剂CuSO4·5H2O，20%NaOH，PEG2000，短棉绒，4硫酸，异丙醇，浓氨水，95乙醇，氯仿，K2HPO4·3H2
5、O，K2HPO4，0.9%NaCl，丙酮，10mmol/LHCl，邻苯三酚（用10mmol/L HCl作溶剂配制，4下保存 ），新鲜猪血500ml，2.5%草酸钾，甲醛溶液试剂规格。22. 仪器烧杯(250mL、500mL、50mL各2个)，量筒(10mL,100mL各一个)，1000mL分液漏斗(1个)，药匙，洗瓶，抽滤装置（抽滤瓶、布氏漏斗各两个），玻璃搅拌棒，恒流泵，自动部分收集器（1个），淋洗液瓶（2个），电磁搅拌器（1个），试管（5mL），台秤，机械水泵，真空干燥器，电炉，注射器及针头，紫外可见分光光度计，分析天平，低温高速离心机仪器的型号，冰箱。三、23 实验步骤1. 酶的制备（1
6、）取新鲜猪血500mL数字和单位是两个单词，它们之间必须有空格（已预先加入50mL2.5%草酸钾作为抗凝剂），3000转/min离心20min去除上层血浆，收集红细胞约250mL，加入等体积的0.9%NaCl溶液，用玻璃棒搅拌充分，洗涤，3000转/min离心20min，弃去上层清液（如此反复3次），收集洗净的红细胞放入800mL烧杯中，加250mL重蒸水，将烧杯置于冰浴中搅拌40min以上，得溶血液500mL。（2）往溶液中缓慢加入在4下预冷过的95%的乙醇125mL，然后缓慢加入在4下预冷过的氯仿75mL，搅拌15min，室温下3000转/min离心20min，弃去沉淀，收集上层清液约33
7、0mL，此即酶的粗提取液。（3）往上述液中加入 141.9gK2HPO4·3H2O和22.3g蒸馏水 ，转移到分液漏斗中，振荡后静止分层（约15min）。收集上层乙醇氯仿相（微浑浊），室温下离心（3500转/min）25min，弃去沉淀，得上层清液约150mL。（4）向所得溶液中加入0.75倍体积的在下预冷过的丙酮， Cu·Zn-SOD便沉淀下来。室温下3500转/min离心20min，收集灰白色沉淀物。将此灰白色沉淀物溶于约5mL蒸馏水中（呈悬浮状），在下，250mL2.5mmol/L（PH值为7.6）的磷酸钾缓冲溶液中透析，每隔半小时换一次透析液，共换45次。透析液内出
8、现沉淀，在室温下3500转/min离心，弃去沉淀收集上清液于小试管中，在冰箱中保存。2. 纤维素柱的制备（1）制备Cu(OH)2取16.5g CuSO4·5H2O加132mL水，搅拌加热至沸后，停止加热，缓缓加入8mL25%28%的浓氨水，并搅拌。冷却至室温后，用水将沉淀洗至中性。倒出清液后，加112mL水入沉淀中，冰水浴条件下加入53mL 20% NaOH溶液并搅拌，再用水洗至中性，抽滤得天蓝色湿的Cu(OH)2（含水率约60%）。（2）制备纤维素铜氨溶液8g纤维素置于56mL浓氨水中，加入13mL水后密封杯口，置于冰箱中冷至10以下。将10.4g含水率约为60%的Cu(OH)2加
9、入到6mL 10% NaOH溶液里，搅拌均匀后倒入上述冷却的纤维素氨水溶液中，立即搅拌均匀，置于冰箱中冷却。冷却后加水13mL，继续搅拌，再冷却，再搅拌使纤维素完全溶解，得到蓝色清亮的粘稠溶液（A），纤维素浓度约为8%，溶液总质量约为100g。（3）柱填料的制备将8g PEG-2000溶于40ml水中，得无色透明粘稠溶液，即20%PEG水溶液（B）。取等体积（约40ml）上步所制纤维素铜氨溶液（A），搅拌下与（B）混合均匀后，在减压条件下抽气20分钟除去其中气泡后，将其装入注射器中，均匀用力推出呈丝状的溶液，直接在10% NaOH溶液中凝固15min后，再将其转移至4%的稀硫酸溶液中，放置30
10、min，可得透明而均匀的细丝。用水洗去酸，再把细丝剪成1mm以下的圆柱体。放在70的水中加热1小时，以除去其中的PEG2000。将制得填料保存于含20%异丙醇和2%甲醛水溶液中备用。此圆柱体为SEC柱填料1#同上方法，不用共混液，而直接用纤维素铜氨溶液（A）可制得SEC柱填料2#3. 纤维素柱层析（1）装柱将所得填料1#和2# 按体积比1：1混合并填充玻璃色谱柱中，填充时不要混入气泡，同时轻轻敲打管壁，使填料填充紧密均匀。装好后，填料上部用滤纸覆盖填料，以保持胶床顶部平整，不受流入溶液干扰。（2）层析用2.5mmol/LpH=7.6的缓冲溶液作柱层析平衡液，用2.5mmol/L200mmol
11、/L（100mL）pH=7.6的磷酸钾缓冲溶液进行梯度洗脱。流速为40mL/h,每管收集4mL，收集大约30管。以磷酸钾缓冲溶液为参比，在280nm处采用紫外吸收法测定每管的吸光度，绘制淋洗曲线。装置如下图。3四、实验结果与讨论数据（1）实验数据列表如下：Ve(mL)481216202428323640ABS11.12721.74371.67301.36831.18051.06840.96550.83040.70320.5784ABS21.12721.74071.67301.36831.17901.06840.96460.83040.70280.5779ABS1.12721.74221.673
12、01.36831.17981.06840.96510.83040.70300.5782Ve(mL)44485256606468727680ABS10.47880.31240.38200.23720.19190.15410.12600.11180.09900.0935ABS20.47900.31240.38160.23710.19250.15380.12590.11150.09890.0934ABS0.47890.31240.38180.23720.19220.15400.12600.11170.09900.0935Ve(mL)84889296100104ABS10.08740.10490.07
13、600.07260.07150.0714ABS20.08740.10470.07600.07250.07140.0712ABS0.08740.10480.07600.07260.07150.0713（2）实验测得的洗脱曲线如右下图：五、结果与3.2 讨论（1）实验中由于操作过程中先加入了酶，之后加入缓冲溶液使柱子充满，造成曲线的前部分丢失。正确的顺序是先加入缓冲溶液使柱子充满，再缓慢加入酶，之后才能开始洗脱。（2）在制备纤维素铜氨溶液时，一定要搅拌至变为蓝色均匀的粘稠溶液，即无纤维素颗粒存在，否则在抽丝过程中容易堵塞注射器。（3）实验时，若发现纤维素铜氨溶液太稠，可加入适量蒸馏水，冷却再搅拌。
14、加入20的PEG 溶液得混合溶液粘度较小，抽丝较容易。（4）装柱时，填料要填充紧密均匀，不要混入气泡，保持柱表面均匀。混合填料由于密度不同给装柱带来了一定的难度。参考文献1 D Lecacheux, G Brigand. Carbohydr Polym, 1998(8):1191302 S C Churms. J Chromatogr A, 1996(720): 1511663 G Yang, L Zhang, J Membrane Sci, 1996(114):1491554 G Yang, L Zhang, X Xiong, et al. Chinese J Polym Sci, 2001
15、(19):4155 L Zhang, J Zhou, G Yang, et al. J Chromatogr A, 1998(839): 1316 McCord, J M, Fridovich I. J Biol Chem, 1969(244): 6049 7 余瑞元等. 北京鸭红细胞超氧化歧化酶分离纯化和性质. 北京大学学报(自然科学版), 1990, 26(4): 4758 袁勤生. 邻苯三酚自氧化测定超氧化歧化酶活性. 医药工业, 1983(1):169 谢卫华等. 邻苯三酚自氧化测定超氧化歧化酶活性的改进. 医药工业, 1988(5):19 英文摘要？批语：1 全文基本具有科研论文的结构，但讨论不够深刻。2 建议参见高等学校化学学报征稿启事中的要求重新修改。 黄驰分数：86分4 / 4文档可自由编辑打印