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1、前人类骨骼DN彝解阻碍因素分析杨周岐，张虎勤，张金，赵文明【关键词】羟基磷灰石Degradative factor analysis of ancient DNA preserved in human bonesAbstract The ancient DNA (aDNA), the most important genetic information of ancient human, has been widely used in the studies of human origin, evolution, racial character, migration and diseases
2、, and herefrom the molecular archaeology has developed rapidly. By virtue of its special structure and physical specialty, the bones have often been selected as theideal aDNA samples. Effected by the outside physical and chemical factors, enzymesand microorganism, the aDNApreserved in human bones wi
3、ll get degraded into small fragments during a long buried or exposed time. By analyzing the structure and specialty of bones, we discussed the preservation of bone structure and the effects of environmental factors on its decomposition and investigated the adsorption effect of matrix framework forme
4、d by bone inorganic phase hydroxyapatite and collagen via calcium bridge on aDNA fragments. Based on the analysis of the characteristics and stability of DNA, we discussed the damages of hydrolyzation, oxidation, enzyme and microorganism to aDNA and studied the influences of the environmental factor
5、s inclusive of temperature, humidity, pH value and microorganism on aDNAdegrading rate. In the end, the survival age limit and the favorable preservation conditions of aDNA were suggested to provide theoretical evidences for the extraction, preservation, sampling and authenticity evaluation of aDNA.
6、【Keywords ancient DNA; degradation; bone; hydroxyapatite【摘要】古DN强古代人类最重要的遗传信息载体，已用于 人类起源、进化、族群特点、迁移、古代人类疾病等方面的研究，由 此致使了分子考古学的兴起.由于骨骼组织独特的结构和物理特性， 其常常被选作较理想的古 DN颇究组织样品.在长期的埋藏和暴露进 程中，受外界物理因素、化学因素、酶解及微生物侵染等作用，前人 类骨骼DN砌子将发生必然程度的降解.通过度析骨骼组织结构及其 物理特性，探讨了骨骼组织的保留及阻碍其分解的环境因素，论述了 骨骼无机相羟基磷灰石与有机胶原质形成的嵌合结构对DNAt段的
7、吸附爱惜作用.在分析DN阴子的特点和稳固性的基础上，探讨了水解反映、氧化反映、酶解及微生物分解作用对古DN砌子造成的降解，研究了温度、湿度、pH值、微生物等环境因素对古 DN解解速度的阻 碍.在此基础上，分析了在不同条件下古DNA(m导以幸存的年代范围， 提出了有利于古DNA呆留的环境条件，从而为古 DNA羊品保留、研究 取样、提取及真实性评估提供理论依据.【关键词】 古DNA降解；骨骼；羟基磷灰石0引言20世纪80年代以来，生物学家别离从古化石、陈腐皮张、 土壤、牙齿和骨骼中成功提取了动物、植物及人类的细胞核DNA线粒体DNA (mtDNA片段和叶绿体DNA>t段，从不同领域、不同视角
8、进 行研究，揭露了古DNA1藏的科学价值.尔后，以性别鉴定、亲缘关 系确信、进化树构建和古代人类疾病为目标的分子考古研究取得了快 速的进展1.古DN颇究的成功与否，专门大程度上依托于所选组 织样品的保留状况、提取方式、扩增引物设计和避免污染的技术方法2.在长期的埋藏或暴露进程中，受环境因素和微生物作用，前人 类软组织在短时间内专门快分解，进而致使其 DN砌子迅速降解，造 成软组织中古DNAI取困难及扩士f成功率较低.骨骼、牙齿等坚硬组 织为古DNA呆留提供了较理想的场所，一方面致密结构大大减弱了环境因素和微生物对组织结构的破坏作用，延缓了古DNA勺降解进程；另一方面骨骼羟基磷灰石对古DN*段具
9、有吸附作用，这种作用使古 DN砌子保留日t刻延长.因此，前人类骨骼和牙齿已被普遍地选作 DNA 分子考古的组织样品3.1骨骼组织结构及其分解人类骨骼组织要紧包括3种细胞，即骨细胞、成骨细胞和破 骨细胞，其细胞间质要紧由胶原质和羟基磷灰石Ca10(PO4)6(OH)Z组成.胶原质由骨细胞分泌产生，约占骨重的30%具有较高的变性温度(超过90C)和良好的热稳固性4.羟基磷灰石约占干骨质 量的65%75%,是骨骼结构支撑物质，具有表面活性，结构呈细针 状，沿胶原纤维的长轴排列，要紧以六方体晶体形态和非晶态形式存 在5.胶原质与羟基磷灰石通过钙桥连接形成的嵌合结构具有必然 的空间效应3,弱碱性条件下D
10、N*段带负电，在羟基磷灰石晶体 表面能够形成化学吸附，这对古 DNA勺保留相当有利.在长期埋藏进 程中，骨骼组织中非晶态的羟基磷灰石将慢慢转变成晶体结构6,这种晶态的转变对古DNA勺保留有两方面阻碍：一方面结晶使骨骼硬 度增强，可减缓外部环境因素的侵蚀；另一方面，结晶度的增加减小 了羟基磷灰石的吸附表面积，使古 DNA勺保留空间减小.羟基磷灰石 晶态结构的改变和可逆分解将加速微生物对骨胶原质的分解，促使胶 原质慢慢分解或矿化，同时胶原质的存在也将有效延缓羟基磷灰石的分解速度.表1阻碍古DN嘛解的因素及结果（略）在埋藏环境中，骨骼组织要紧发生 3种形式的分解3:胶 原质水解、骨矿物质分解及微生物
11、的分解作用.当骨骼与埋藏环境处 于热力学平稳时，骨胶原质的化学水解占主导地位，常常致使骨骼发 生矿化.游离态H2O的存在对骨骼的保留极为不利，可加速胶原质的 水解和羟基磷灰石的溶解.当温度转变时溶解的羟基磷灰石从头结 晶，表面吸附F-, Sr2 + , Mga , SiO32-和CO32等离子，这些离子 与矿物离子间的互换将致使骨骼晶体结构发生改变.在强酸或强碱性 条件下，羟基磷灰石的结构将被完全破坏，胶原质肽键也将水解形成 肽片段（对碱催化更灵敏）.胶原质的矿化使骨结构组织发生降解， 造成古DNA以存在的物质基础和爱惜屏障的破坏，必将致使古DNA的稳固性大幅降低.样品组织中阻碍氨基酸残基外消
12、旋反映的因素一样阻碍DNA链的脱碱基进程.在组成蛋白质的氨基酸中，天冬氨酸（Asp）的外消 旋反映速度最快，其速度和反映活化能与 DNAK摆脱碱基的速度和活 化能相当.实验研究发觉，当Asp的D/L比率超过时即很难提取到有 效的DNAt段（极限值为），这一比率越低，提取的DNAt段越长.因 此检测骨组织中氨基酸外消旋反映速度能够为确信样品中是不是含有 古DN*段提供证据7.2DNA勺降解目前，分子考古研究要紧集中于核 DN府口线粒体DNAmtDNA 方面.mtDNA属细胞核外遗传物质，在细胞内有几千个拷贝，片段较 小，受酶解及外界因素作用位点少，因此降解速度相对较慢；核 DNA 分子相对较大，
13、降解速度快，相较较而言 mtDNAt段比核DNAt段提 取的成功率略大.水解反映、氧化反映及微生物分解反映是造成DNA降解的要紧缘故8.水解反映水解反映第一发生在碱基与糖环相连的N-糖昔键上，反映要紧受酸催化差遣.当双链DN侬性形成单链时，水解反映 更易发生.如对双链和单链DN原讲，其碱基水解的速度相差4倍.对 不同碱基来讲，水解的速度不同更大，如鸟喋吟和腺喋吟的水解速度 相当，而胞喀咤与胸腺喀咤的水解速度仅为前者的5%.由于羟基磷灰石的吸附作用，骨骼组织中 DNA勺脱碱基速度将减慢一半9,当 维持DN婵链稳固的要紧作使劲磷酸二酯键水解断裂后，将形成许多 DNAS片段.酸、碱催化作用都可致使碱
14、大体身水摆脱去氨基（如胞喀咤 脱氨基形成尿喀咤，腺喋吟脱氨基形成次黄喋吟）.由于双螺旋结构 的爱惜作用，DNA®链碱基的脱氨基速度相对减慢，如对单链 DN减 讲，在37 C , pH的溶液中，胞喀咤转化为尿喀咤的半衰期为 200年，而双链DN砸喀咤的脱氨基速度仅是单链 DNAJ%这意味着在相 同条件下双链DN龈喀咤的半衰期可达3万年.喋吟碱基的脱氨基反 映那么较少发生，如腺喋吟脱氨基生成次黄喋吟的速度仅为胞喀咤脱 氨基速度的2%3% 10.阻碍水解反映的因素温度：古 DN恪历的热历史对其稳固 性有专门大的阻碍，热历史涉及古 DNA呆留环境的平均温度及温度波 动.通过下式可对骨骼DNA
15、分子脱碱基速度进行估算11:K=Aexp（-Ea/RT） （pH ,其中：Ea=127kJ/mol , A=x 1011/s, R=J/kmol,T 为热力学温度）.经计算可知，古DNAB 0c保留12万5000年，10C 保留1万7500年，而在20 c下仅保留2500年12.从化学降解来 讲，温度降低20C,生物大分子的分解速度降低 1025倍，因此低 温环境对古DNA勺保留最为有利13.低温条件限制了微生物的活 性，降低了液态水的含量，使得要紧依托液态水而发生的化学分解及 生物降解速度大大降低.如通过试管内降解实验（70 C, pH说明，水 溶液中DNA自发脱喋吟的速度为4X10-9/S
16、 ,由此估量古DN阴子能 够保留的理论极限为10万年.研究还发觉热诱导产生的脱氨基速度 比酸碱催化的脱氨基速度更高，因此从埋藏学的角度来看，低温环境 不管从物理、化学及生物学方面均有利于 DN砌子的保留.pH值： 弱酸性环境中，如pH时，连接喋吟与核糖的糖甘键会发生断裂（碱 基甲基化后更易发生）；当pH小于1时，DNA勺磷酸二酯键那么会水 解断裂.强碱性环境中，喋吟分子结构会发生酮式与烯醇式结构的转变，阻碍特定碱基间的氢键作用，致使 DN破链发生变性.因此，不 管在强酸性或强碱性环境中，都使 DNA吉构发生转变，进而加速 DNA 的降解.湿度：游离态H2O的存在将直接促使DN粉子水解，这在 必
17、然程度上是难以幸免的，因为样品保留环境和骨质孔状结构为H2O的存在提供了条件.环境湿度大，有利于水解反映的发生，并促使羟 基磷灰石与古DN期生脱附作用；湿度较小或极度干燥，那么使 DNA 结构发生转变.离子强度：高离子强度的可溶盐体系中，磷酸二酯 键分解速度可减慢510倍9.这是由于DNAU上PO43#负电荷， 造成DN砌子间存在排斥，在高盐浓度下，负电荷被中和，其斥力降低， 使得DNA急固性相对提高.氧化反映DNA勺氧化要紧发生在碱基残基上，致使碱基的缺失或更迭.由于线粒体是有氧代谢的中心，因此 mtDNAt匕核DNA更易受到氧化作用的阻碍.在氧气、超氧化物、过氧 化物及羟基自由基等活性氧多
18、位点解决下，DNA碱基发生修饰进而产生一系列氧化产物14.喋吟碱基的氧化：最易产生的氧化产物 是8羟基鸟喋吟，其优先与腺喋吟结合而不是与胞喀咤配对，破坏了 DNAM初的氢键结构，从而降低 DNA勺稳固性.第二还生成8羟基腺 喋吟、4,6二氨基5甲酰胺腺喋吟、2,6二氨基4羟基5甲酰胺鸟喋吟 等氧化产物.这些产物从全然上改变了 DN阴子的大体组成，最终使 DNA分子完全降解15.喀咤碱基的氧化：喀咤碱基被氧化形成 环状饱和结构，如5羟基5甲基乙内酰月尿、5羟基乙内酰月尿（胸腺喀 咤的降解产物）及较少的5羟基尿喀咤和5,6二羟基尿喀咤，它们能 够进一步被氧化分解形成短片段.还有一种氧化作用是由于在
19、碱基和糖一磷酸骨架链之间以额外的共价键相连形成环状喋吟脱氧核糖核 甘，使DNA1旋结构发生变形，进而致使 DN砌子发生降解9.阻碍氧化作用的因素温度：低温条件下物质迁移速度降低， 氧气及氧离子的活性受到抑制，从而降低 DN砌子氧化速度.H2O 液态水是氧化反映的介导物质.一方面H2O的渗透将溶解其中的氧气 直接带进埋藏环境，另一方面 H2O的存在促使氧离子的生成，进而加 速DNAM化速度.电磁辐射、紫外辐射（尤其 UVBffi UVC及核辐 射对古DNA勺氧化也产生必然阻碍.电磁辐射增强氧化性离子或分子 的活性，致使超螺旋DN桐线性DN粉子的车专变16, 17.紫外辐 射促使DN砌子构型发生转
20、变，并增进氧化剂的活性，致使DN砌子的氧化降解作用加重.酶解及微生物分解作用核酸酶及土壤微生物对DNA勺降解作用是相当重要的一个因素.真核生物核DNAW组蛋白结合以核小体大 体单位存在，缠绕于单个核小体八聚体组蛋白核心上的DNA勺为146bp,已提取的古DNAt段绝大多数为100200 bp,二者之间刚巧吻合. 这是由于核酸酶活性维持时刻短，且对金属离子有依托性，如钙、镁 离子利于酶活性的维持，而高浓度钾离子抑制其活性18.当组蛋 白被降解后，核酸酶的活性已慢慢丧失，因此组蛋白阻止了核DN蹴进一步酶解.另外，酶解是一个需能进程，而封锁埋藏环境中由于氧 的缺乏将切断其能源供给，因此核酸酶的降解作
21、用受埋藏方式的阻碍.当人体骨骼矿物组织及有机相取得破坏后，微生物对DNA勺降解作用将超级显著.通过研究土壤微生物（包括细菌、酵母及霉菌）对DNA的分解作用，发觉微生物分解作用可生成一系列寡核甘酸，进一步降 解那么生成胸腺喀咤、次黄喋吟、黄喋吟、尿喀咤及胞喀咤等残基19. 微生物分解作用与埋藏环境的温度、湿度、pH值等紧密相关，低温、干旱的环境对微生物生长及酶活性有较强的抑制作用，有利于对古 DNA勺保留20.3结论综合以上分析，前人类骨骼 DN砌子的降解与埋藏环境或放 射性同位素O UVS射只破坏样品表面DNA但可激活氧离子，加速 DNA氧化进程代谢气体的形成及软组织破坏，可加速微生物的破坏作
22、 用，深度埋藏将大大减弱辐射作用，有利于古DNA勺保留因素如温度、 湿度、土壤特性、微生物及组织分解产生的有机物（如腐殖酸、棕黄 酸）等紧密相关.低温、干旱、弱碱性及微生物较少的封锁环境对古 DNA勺保留最为有利（表1）.我国西北、华北、东北地域年平均温度 较低，土壤湿度小，散布着众多的考古遗址，是分子考古研究选样较 为理想的地域.在进行古DNA®织取样时，需依照埋藏地的实际环境 因素做全面的分析，综合考虑致使 DN砌子发生水解、氧化反映的因 素及微生物种类，同时结合物理、化学方式对骨质结构及成份进行分 析，以便为古DNA勺提取、组织选样及真实性评估提供依据.【参考文献】1 ORou
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