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1、小鼠腹腔注射LD50的测定标准操作规程（SOP）点击次数：1208 作者：leancao 发表于：2008-08-22 00:00 转载请注明来自丁香园 来源：丁香园【目的】通过实验学习测定药物 LD50的方法、步骤及计算过程，观察受试药品一次给予动物后所产 生的急性毒性反应和死亡情况。【原理】药物给药剂量与动物死亡率间呈正态分布，以对数剂量为横坐标、死亡率为纵坐标作图， 可得到一对称S型曲线，其两端较平坦，中间较陡，说明两端处剂量稍有变化时死亡率的改变不易表现出 来，在50%死亡率处斜率最大，该处剂量稍有变动时，其死亡率变动最明显，即最灵敏，在技术上也最容 易测得准确，所以人们常选用 LD5
2、0值作为反映药物的指标。若将死亡率换算成机率单位，则对数剂量与 机率单位呈直线关系，用数学方法可拟合其回归方程式，可精确地计算 LD50及引起任何死亡率的剂量及 相关数据。【器材】注射器（1ml）、天平、小鼠笼、苦味酸。【药品】盐酸普鲁卡因【动物】1822g健康小鼠50只（正式试验），雌雄各半（雌鼠应无孕），实验前禁食12h,不禁水。【方法】1 .预试验 目的是寻找引起0%和100%动物死亡的剂量范围，以便正式实验时确定各组剂量。一般 是取小鼠912只，分34组，选择组距较大的一系列剂量腹腔注射给药，观察出现的症状并记录死亡 数，找出引起0%及100%死亡率，至少应找出引起 20%80%死亡率
3、的剂量范围，以保证量 -效曲线跨越足够的范围。普鲁卡因小鼠腹腔注射 （ip）引起0%和100%动物死亡的剂量范围的参考值为：最小剂量（Dmin ） 121.3mg/kg ，最大剂量（Dmax ） 290mg/kg2 . 剂量计算及药液配制（1）剂量计算Dma根据预试结果找出 Dmax及Dmin ,设正式实验的剂量组数为n,剂量公比为r,则各组剂量为x rk-1 , k为第几组，一般选用 45组动物，r为0.60.85为宜。例 已知普鲁卡因Dmin=121.3mg/kg ， Dmax=290mg/kg当 n=6 时， r=0.84, 各组剂量为：1. 290 mg/kg2. 290 mg/kg
4、X0.84 = 243.6mg/kg3. 290 mg/kg X0.842= 204.6mg/kg4. 290 mg/kg X0.843= 171.9mg/kg5. 290 mg/kg X0.844= 144.4mg/kg6. 290 mg/kg X0.845= 121.3mg/kg2）药液配制药源充足时的配药方法最高浓度药液（母液）的配制小鼠腹腔注射体积为 0.2ml/10g= 20ml/kg ,每组药液量为4ml左右，为留有余地，各组动物所需药 液体积定为6ml o求出所需母液体积(V)及母液所需药量(M)V=各组动物所需药液体积 / (1-r)= 6 / (1-0.84)=37.5mlM
5、 = V ' Dmax/(20ml/kg)=37.5(290/kg) /(20ml/kg)=543.75mg各剂量组药液按下法稀释：生理盐水至37smI,混为f第一组取J315nd十生理盍水Gnnb流匀f第二组取8mlI31.5irih生理盐水6mh混与f ,第三组取6ml4miSm并生理盐水3ml,海匀一第四组取白ml4315ml十生量盐水15mh混句f第五组取8mEJ313W+生理盘水白mb福与，为第六组药液药源紧张时的配药法各组所需母液的体积(ml)为：第一组 6,第三组6'r2,第五组6'r4 ,第二组6' r,第四组6'r3 , 第六组 6&#
6、39; r5 母液总体积(V)=6'(1+ r+ r2+ r3+ r4+ r5)总药量(M)=母液总体积Dmax/ ( 20ml/kg )计算出V、M后，取药量M,用生理盐水稀释至 Vml,用移液管精密吸取各组所需的母液量，加生 理盐水稀释至6ml ,即为各组试验药液。18.0 18.9g )小鼠放入一个笼内,3.动物分组：将小鼠雌、雄分开。分别称重，同一重量段(如标记小鼠。雌、雄小鼠分别按重量顺序分层随机分为6 组，使不同性别和体重的小鼠能均匀分配于各组，每组 10 只。4给药：各组动物分别腹腔注射相应浓度的药液0.2ml/10g ，立即详细观察，记录动物反应情况、死亡时间和数目。在
7、24h 内作多次观察，以后每天观察1 次以上，连续观察714 天。按 Bliss 法及其它方法计算 LD50 和 95% 可信限（由于Bliss 法计算复杂，可用相关的软件进行处理）。【结果】记录于表T1-1 。【注意】（1） 随机性：实验中能控制的因素尽量使之均衡化，难以控制的因素也应力求严格随机化。分组时应先将不同性别分开，再将不同体重分开，然后随机分配，此法称为分层随机分组法。（ 2）剂量按几何级数排列，转换为对数后，剂间为等距，便于计算结果，估计误差。相邻高低剂量之比一般为1:0.61:0.85,剂距小，结果较精确，但过小易出现反应率颠倒的情况。剂距的大小也与给药途径有关，静脉给药时，
8、剂距可偏小，灌胃给药时可适当偏大。（ 3）药物及给药途径应以静脉注射、腹腔注射和灌胃给药为主，选取的途径必须包括推荐临床给药途径。（ 4） LD50 受试验中多种因素的影响，如动物的品系、性别、年龄、饥饱以及环境因素中室温、湿度、光照、时辰（上、下午）等。当进行两药的毒性比较时，应尽可能在相同条件下进行，以减少抽样误差。（ 5）在试验过程中应详细记动物的中毒症状及可能致死原因，必要时解剖死亡动物肉眼观察，如发现有组织病变时，可进行组织学检查，通常动物死亡多出现在给药后12日内，但全部试验应观察7日以上，如遇有迟发性或进行性中毒反应时，需根据实际情况延长观察时间。若发现中毒反应和死亡率对不同动物性别有明显差别，则应选择比较敏感的性别进行试验。（6）当药物毒性小，以最大浓度和最大体积给药后仍测不出致死毒性时，可测定最大耐受量：即用临床试验的给药途径，以动物能耐受的最高浓度、最大容积的剂量1次或1日内连续23次给予动物（小白鼠至少20只，雌雄各半），连续观察 7天，详细记录动物反应情况，以不产生死亡的最大剂量为 最大耐受量。娼别布重对数剂重动物敷 （只）死亡劫捌数（只）死亡率 （%）几率单位LD找及。瓠置121Z_ 41q516