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1、大肠细菌的基因芯片鉴定,1,实验三基因芯片鉴定大肠细菌,大肠细菌的基因芯片鉴定,2,基因芯片： 是指将特定的DNA或寡聚核苷酸片段通过物理化学方法固定于玻璃、尼龙甚至塑料片上,使多基因分析可同时进行的一种装置。 基因芯片上可固定不同物种特定基因的探针，将从样品中提取并经PCR扩增和荧光标记的特异基因片段与基因芯片上的探针杂交，利用专门的光学仪器，能够检测到这些杂交信号（带有荧光标记的双链核酸），杂交信号出现在某物种的探针位点上，说明样品来自于该物种。,大肠细菌的基因芯片鉴定,3,基因芯片上固定探针的方法,通过化学修饰可以使玻片成为表面富含氨基的基片。在中性溶液中，基片上的氨基所带的正电荷与核酸
2、分子上的磷酸所带的负电荷相互作用，使核酸吸附在基片表面。加热和紫外照射可以增强固定效果，但紫外交联容易导致DNA断裂或DNA分子间形成干扰杂交的网状结构，所以一般还是采用加热固定。 本实验使用的基因芯片上固定有大肠杆菌HSP70基因和黄单胞菌HTPG基因的特异探针，可用于鉴定这两种细菌。,大肠细菌的基因芯片鉴定,4,基因芯片制作和检测的原理,大肠细菌的基因芯片鉴定,5,实验方案,本实验共分为四个部分： 一、大肠杆菌培养 二、提取大肠杆菌基因组DNA 三、PCR扩增其HSP70基因，电泳检测扩增产物 四、扩增产物与基因芯片杂交并检测杂交信号,大肠细菌的基因芯片鉴定,6,第一部分 细菌培养,配制1
3、00ml LB液体培养基，蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠1g，加重蒸水100ml，用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。 将大肠杆菌单菌落接种于LB培养基中，37恒温摇床上培养过夜，摇床转速约为280r/min。,大肠细菌的基因芯片鉴定,7,第二部分提取纯化大肠杆菌基因组DNA,大肠细菌的基因芯片鉴定,8,第二部分 实验步骤,1、取培养的菌液10ml，4000r/min离心10min，除去上清液。2、加入1ml TE，使细菌沉淀充分悬浮。3、加入0.2ml 10% SDS 溶液，再加入10l 20 mg/ml 蛋白酶K， 37水浴中温育1h。(SDS溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜
4、蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白。)4、取出离心管，加入0.2ml 5mol/L NaCl 溶液，混匀后再加入0.2ml CTAB/NaCl 溶液，65水浴中温育20min。,大肠细菌的基因芯片鉴定,9,5、加入与菌液等体积（1.6ml）的苯酚/氯仿/异戊醇混合液，用漩涡混合器混匀，4000r/min离心10min。注意吸取混合液前将混合液充分振荡混匀。6、取上层水相至无菌离心管，再加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，用移液器反复吹打混匀，4000r/min离心10min。7、将上层水相转移到另一个无菌离心
5、管中，加入2l RNase A，37水浴中温育30min。8、加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，充分振荡，抽提残留在水相中的苯酚。4000r/min离心10min。9、将上清液移至新的离心管中。,大肠细菌的基因芯片鉴定,10,10、加入上清液1/10体积的3mol/L NaAc溶液，以及上清液2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀以沉淀DNA。室温下静置10min，DNA形成白色（或淡黄色）絮状沉淀。11、用移液器轻轻吸住白色絮状沉淀，将其转移到装有适量75%乙醇的1.5ml离心管中。上下颠倒漂洗，洗去杂质。7500r/min离心5min。12、去上清液，沉淀干燥后溶解于100l TE中。,大肠细菌的基因
6、芯片鉴定,11,取10l提取的基因组DNA溶液加1.99ml水稀释后测量OD260，蒸馏水作为空白，计算DNA产量（1 OD26050g DNA/ml）。 -20贮存其余基因组DNA，待下一实验用作PCR反应的模板。,DNA产量测定,大肠细菌的基因芯片鉴定,12,试 剂,1、TE：10mmol/L TrisHCl，1mmol/L EDTA2、CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）/ NaCl：将4.1g NaCl溶解 于80ml水中，缓慢加入10g CTAB，定容至100ml。3、苯酚/氯仿/异戊醇混合液：水饱和酚 : 氯仿 : 异戊醇 = 25 : 24 : 1（体积比）。4、氯仿/异戊醇混合液：
7、氯仿 : 异戊醇 = 24 : 1（体积比）。5、10g/l RNase A 10% SDS 20 mg/ml 蛋白酶K 5mol/L NaCl 3mol/L NaAc 无水乙醇 75%乙醇。,大肠细菌的基因芯片鉴定,13,第三部分 PCR扩增,大肠细菌的基因芯片鉴定,14,PCR反应程序,大肠细菌的基因芯片鉴定,15,第四部分基因芯片杂交和检测,大肠细菌的基因芯片鉴定,16,每个阵列的探针排布,标记有HEX的核酸,（无标记的大肠杆菌HSP70基因扩增产物）,（无标记的黄单胞菌HtpG基因扩增产物）,50%DMSO,大肠细菌的基因芯片鉴定,17,器材,耗材,软件,大肠细菌的基因芯片鉴定,18,
8、实验步骤,（1）准备芯片：去掉杂交围栏上的胶纸，将杂交围栏放在杂交模具中心的同样形状的凹槽中，胶面朝上，注意要使杂交围栏与凹槽契合。用手捏着芯片上贴有标签纸的一端，将芯片另一端顶着模具的顶端，然后将芯片正面（贴有标签纸）朝下放入模具。在芯片背面相应位置用镊子轻轻向下按，使杂交围栏紧贴在芯片上。,大肠细菌的基因芯片鉴定,19,撕去围栏上的保护纸,大肠细菌的基因芯片鉴定,20,贴 围 栏,大肠细菌的基因芯片鉴定,21,第四部分 实验步骤,（2）往杂交盒底部凹槽中均匀加入少量蒸馏水（约200l），以防止杂交过程中杂交液大量挥发。把芯片有杂交围栏的一面朝上放入杂交盒中，按芯片摆放方向盖上盖片，注意使盖
9、片上的凸面朝下。,盖片,芯片,标签端,盖片正面观,大肠细菌的基因芯片鉴定,22,往杂交盒底部的凹槽中加水,大肠细菌的基因芯片鉴定,23,将贴好围栏的芯片放入杂交盒,注意：围栏朝上,大肠细菌的基因芯片鉴定,24,盖上盖片,注意：盖片的凸起面向下,大肠细菌的基因芯片鉴定,25,第四部分 实验步骤,（3）杂交：将杂交液用移液器混匀后3000r/min离心30s，95热变性3min。冰浴骤冷1min。用移液器将杂交液注入盖片上的小孔。盖上杂交盒的盖板，两侧用两个卡子扣上，确保杂交盒的密封性。在42水浴中杂交2小时。,大肠细菌的基因芯片鉴定,26,加杂交液,大肠细菌的基因芯片鉴定,27,盖上盒盖，插上卡
10、子,大肠细菌的基因芯片鉴定,28,放入恒温水浴中保温,大肠细菌的基因芯片鉴定,29,第四部分 实验步骤,（4）清洗：洗液先预热至42。将芯片转移到盛放洗液的清洗盒中，杂交面朝上，放在水平摇床上清洗。依次在洗液、中各清洗4分钟。然后放在50ml锥形离心管中（标签纸端朝下），1500 r/min离心1分钟以除去芯片表面的水分。（5）扫描及结果测定：启动微阵列芯片扫描仪系统，进行芯片扫描，保存检测结果。,大肠细菌的基因芯片鉴定,30,清洗,甩干,大肠细菌的基因芯片鉴定,31,基因芯片扫描仪,微阵列芯片扫描仪EcoScan100,大肠细菌的基因芯片鉴定,32,基因芯片扫描仪工作原理,大肠细菌的基因芯片鉴定,33,基因芯片扫描仪工作流程,大肠细菌的基因芯片鉴定,34,软件界面,大肠细菌的基因芯片鉴定,35,大肠杆菌的检测结果,大肠细菌的基因芯片鉴定,36,黄单胞菌的检测结果,大肠细菌的基因芯片鉴定,37,试 剂,（1）20SSC：在800ml水中溶解175.3g NaCl和88.2g柠檬酸钠，加入数滴HCl溶液调pH至7.0，加水定容至1000ml，分装后高压灭菌。 （2）杂交液：6l 100甲酰胺，0.24l 10SDS，1.8l 20SSC和4l荧光标记的PCR扩增产物。 （3）洗液：2SSC，0.2% SDS （4）洗液：0.2SSC,