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1、ChIP、RIP、RNA-pull-down、EMSA Luciferase 原理1 ChIP实验通过与染色质片段共沉淀和 PC曲术，在体内检测与特异蛋白质结合的 DN*段将处于适当生长时期的活细胞用甲醛交联后将 细胞裂解，染色体分离并打碎为一定大小的片段200bp-1000bp;然后用特异性抗体免疫沉淀目标蛋白与DNA交联的复合物，对特定靶蛋白与 DNAt段进行富集。采用低pH值条件反交联，DNA 与蛋白质之间的Schiff 键水解，释放DNAt 段。通过对目标片段的纯化与检测,获得DNAf 蛋白质相互作用的序列信息。CeiStep I：CrosslinkingStep 2: Cell Ly
2、sisStep 4: immunop rec tphaltonS1ep 5:Crosshnking Reversal and DNA Olean-upStep 3:Chramation DigestionqPCRI1生物图2 ChIP实验流程RIP 技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation , RNA吉合蛋白免疫沉淀）， 是研究细胞内RNAW蛋白结合情况的技术。运用 针对目标蛋白的抗体把相应的 RNA蛋白复合物 沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复 合物上的RNA4行分析；即用抗体或表位标记物 捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA吉合蛋白，防止
3、非特异性的RNA勺结合，免疫沉淀把 RNA吉合蛋白及其结合的 RNK起分离出来，结 合的 RNA15歹U通过 microarray （RIP-Chip）, 定量RT-PC越高通量测序（RIP-Seq）方法来 鉴定。是了解转录后调控网络动态过程的有力工 具，能帮助我们发现 miRNA勺调节靶点。.c_zControl多聚檎糖体(Polysome) 裂解液中进行裂解Q使用MG蛋白硬珠及抗体对目标蛋白迸行免疫沉淀利用磁性限定与磁球结合的赞合物并洗脱未结合的物质/ SEPOinsr prcJfr naKhAS丫 AfVibotfy。解即近6eod4 Mfl* 用赛诚生物图3 RIP实验流程3 RNA
4、pull-down 实验使用体外转录法标记生物素 RN麻针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA蛋物洗脱后WashWashSticphavidihMagne lie Bcdt赛诚生物 d proleins RMAM3$ spectrorneryRNA吉合蛋白是否与RNAff互作用珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁blaringCaptj labeJed PNAwtth streptavidin magnetic beadswestern blot实验检测特定的Label RNA using T4 mA liga$G广州赛诚生物 www 9 esc b
5、id co mProbe AntibodySu浅节hift to-Shift Free Probe .图4 RNA pull-down实验流程4 EMSA 验凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA-electrophoretic mobility shiftassay)是一种研究DNA吉合蛋白和其相关的DNA 结合序列相互作用的技术，可用于研究DNA吉合 蛋白和其相关的DNA吉合序列相互作用、DN妮 性和定量分析。生物素标记的探针依研究的结合 蛋白的不同，可是双链或者是单链ProteinSp&ciffc competitorMutant/non competitor5 Luciferase 实验荧
6、光素酶(Luciferase )是自然界中 能够产生生物发光的酶的统称，不同的能够控制 发光的生物体用不同的荧光素酶来催化不同的 发光反应。萤光生成反应通常分为以下两步： 萤光素+ ATP-萤光素化腺甘酸(luciferyl adenylate ) + PPi萤光素化腺甘酸+ O2 一氧萤光素+ AMP胱荧光素酶的基因可以被合成并插入到 生物体中或转染到细胞中，将不同类型的细胞 (骨髓干细胞、T细胞等)标记上(即表达)荧 光素酶，就可以用高敏感度的CCDtf机进行对动 物体内进行活体观察而不会伤害到动物本身。在荧光素酶中加入正确的萤光素底物就可以放出 荧光，而发出的光子可以被光敏感元件，如萤光
7、探测器或改进后的光学显微镜探测到。这就使得 对包括感染在内的多种生命活动进程进行观察 成为可能。Promoter?Enhancer LXJC-广摺赛诚生物yzBPotential regulatory proteinNon-cambi nationNormal榛LucGambi nationUp-regulated(Njucwn-rtsppwe-Fm/f 曲t?JH.j .犷和u；iMSV-TK. p( 七 moEerSV40Earl/ E nbanctr/ P-romot&r图6 Luciferase研究增强子原理ILuuP-, wtbKjt-AlWjeHIWSV40ApoM 用 sjgci
8、aiTvJr7 ptiCMECKVector17 zFromcrerr图7 Luciferase常用载体Cleave with restriction ,、enzyme at AECAJB/Digest with exonucleases /min 1)Attach linker withDNA ligase图8 Luciferase片段缺失分析实验流程TemplateDNAPCR with mutagenic primerM枚 remove primers denature reanneal5Jll1PCR with end primers广州赛诚生物 图9 Luciferase定点突变分析
9、实验流程荧光素酶分析可应用于启动子研究中 分析顺式作用元件和反式作用因子、药物筛选、 siRNA和miRN睡选、分泌途径及蛋白定位报告 基因检测、活细胞的实时动态研究、信号转导通 路分析、难转染的细胞（包括干细胞和原代细胞） 的研究、RNAW接研究。双荧光素酶报告基因测试，是结合萤 火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测 试技术。在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时， 通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因 素。双荧光素酶报告基因测试系统，结合pRL载 体系统，表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素 酶，在单管中进行双荧光素酶报告基因测试， 快 速、灵敏、简便。其应用广泛，可同时分析多个 调控元件、同时分析多个信号转导通路、单次筛 选一个以上的靶点（包括脱靶效应、分析两个或 多个通路之间的相互作用）。