《EDU-细胞增殖检测.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《EDU-细胞增殖检测.docx（7页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、荧光显微镜检测方法（以96孔板，A549贴壁细胞为例）细胞培养取对数生长期细胞，以每孔3司取10（5细胞接种于96孔板中，培养至正常生长阶段。药物处理（可选）客户可以根据实验需要进行各种药物处理。EdU标记1.1 用细胞培养基按1000 : 1的比例稀释EdU溶液（试剂A）,制备适量50 m M EdU基；注：1）EdU浓度与孵育时间相关，短时间孵育（2h）宜采用高浓度（105& M）,长时间孵育（24h）宜采用低浓度 （110 M）;2）如果需配置10 m M EdU基，需调整为5000 : 1稀释比例；3）配置好的培养基的保存时间取决于培养基的性质。表1 EdU培养基及染色反应液的使用量参
2、考96孔板*48孔板24孔板12孔板6孔板5.5 cm 小皿EdU培养基10011 115011 120011 130011 150011 12 mL染色反应 液10011 115011 120011 130011 150011 12 mL注：1）*表示贴壁细胞通常采用的培养容器，EdU培养基与染色反应液用量以覆盖细胞为宜;2）悬浮细胞EdU用量依据培养体积而定。1.2 每孔加入 100dL 50科MEM孵育2小时，弃培养基；注：1）最佳孵育时间与细胞周期相关 （表2）,大多数细胞系均可采用 2小时孵育时间；2）EdU培养基用量以没过细胞为宜，但需要保证EdU孵育时间内的营养物质持续供给俵1）
3、；1.3 PBS清洗细胞12次，每次5分钟。注：清洗目的是将未渗入 DNA的EdU洗脱，清洗方式依据不同的细胞类型而定，贴壁不牢的细胞请降低清洗强度。表2 EdU孵育时间设定参考3T3HelaHEK293*细胞系人胚胎细胞酵母细胞人成纤维细 胞人宫颈癌细 胞人胚肾细胞系人神经细胞细胞周期30min3h18h21h25h5d孵育时间5min20min2h2h2h1d注：1）EdU孵育时间取决于细胞周期，一般为细胞周期的1/10至1/5，但大多数细胞系均可采用2h孵育时间。孵育时间越长，细胞增殖数量就越多；2）*考虑到细胞培养基、温度、湿度、光线等其他因素的影响，具体实验的细胞群体细胞周期会有所变
4、化。表3细胞实验EdU孵育浓度及时间参考PubMed IDReferenceCell lineConcentrationTime18272492Salic A, et al. PNAS . 2008NIH3T3, Hela10 nM-101 hr18521918Cappella P, et al. Cytometry A . 2008HL-60,A2780,U2OS11030 min18996411Chehrehasa F, et al . J Neurosci Methods.2009Neurospheres12024 hr19179371Limsirichaikul S, et al. N
5、ucleic Acids Res. 2009Primary fibroblasts101,2,4 hr19253396Warren M, et al. Dev Dyn . 2009Chick embryos10 m M-2 mM4 hr19647746Yu Y, et al. J Immunol Methods. 2009Spleen cells5024 hr19544417Momcilovi? O, et al. Stem Cells . 2009Human ES cells1030 min20080700Cinquin O, et al. PNAS. 2010emb-301 gM12 hr
6、20025889Han W, et al. Life Sci . 2009VSMC502 hr20659708Huang C, et al. J Genet Genomics . 2010ESC502 hr21310713Hua H, et al. Nucleic Acids Res . 2011fissionyeaststrains103 hr20824490Lv L, et al . Mol Cell Biochem . 2011EJ cells504hr21248284Yang S, et al. Biol Reprod . 2011GC cells502 hr21227924Zhang
7、 YW, et al. Nucleic Acids Res . 2011U2OS, HT293090 min21829621Guo T, et al. PloS One . 2011HIT-T15504hr21980430Zeng T, et al. PloS One . 2011MCF-10A252hr22012572Ding D, et al. Int Orthop . 2011C3H10T1/21024hr22000787Zeng W, et al. Biomaterials . 2011EPC504hr21913215Xue Z, et al. J Cell Biochem . 201
8、1SGC79012524hr22016038Peng F, et al. Lasers Med Sci . 2011MSC502hr218786Li D, et al. J Biol Chem . 2011HCC502hr注：如果您有采用 BrdU进行实验的经验，可以参照 BrdU实验的相关参数进行 EdU实验。细胞固定化2.1 每孔加入50遂阴包固定液（即含4%多聚甲醛的PBS）室温孵育30分钟，弃固定液；注：1）低浓度的多聚甲醛有利于细胞结构的保持，当需要抗体染色时，需采用Triton X-100透化细胞以利于抗体进入细胞内。2）可采用其他方式进行细胞固定。2.2 每孔加入50科L 2 m
9、g/m时氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液；注：目的是中和多聚甲醛， 保证染色反应体系，当采用其他方式进行细胞固定时可酌情省略此步骤；2.3 每孔加入100科L PBS ,脱色摇床5中，弃PBS;2.4 （加强）每孔加入100渗透剂（0.5% TritonX-100 的PBS）脱色摇床孵育10分钟;PBS清洗1次，5分钟。注：当实验需要进行其他抗体染色时，或由于某些细胞类型对染料的吸附性较高，可能需要增强细胞膜通透性。普通细胞可以省略。Apollo 染色3.1 每孔加入100的L1X Apollo?染色反应液表3）,避光、室温、脱色摇床孵育 30分钟后，弃染色反应液；注：1）染色液用量与
10、细胞量相关，以覆盖细胞为宜（表1）;2）孵育时间可以进行适当调整，调整范围为 1030分钟。表4 Apollo?染色反应液的配置参考（现用现配）配制顺序Apollo ?染色反应液500 l L*1 mL5 mL10 mL1去离子水469 gL938 g L4.69 mL9.38 mL2Apollo ?反应缓冲液（试剂B）25 gL50 gL250 gL500 ii L3Apollo ?催化剂溶液（试剂C）5vL10 gL50 g L100 ii L4Apollo ?荧光染料溶液（试剂D）1.5 gL3 g L15 ii L30 gL5Apollo ?缓冲添加剂（试剂E）5 mg9 mg44 m
11、g88 mg注：1）*表示通常配制的 Apollo?反应液的体积足以进行510个孔（96孔板）染色；2）按顺序配制适量 1X Apollo?染色反应檎破坏正常的反应体系 （现用现配，30分钟用完）；3）试剂E为白色粉末，较易氧化，使用后请旋紧管盖，如试剂出现棕黄色，则需更换；粉末较难准确称量，称量误差范围可稍微放宽，但不应超过土20%。3.2 加入100 隧透齐ij （0.5% TritonX-100 的PBS）脱色摇床清洗23次，每次10分钟，弃渗透剂；3.3 （加强）每孔每次加入100 训IL青洗12次，每次5分钟；PBS清洗1次，每次5分钟。注：由于某些细胞对染料的吸附性较高，需采用加强
12、方式洗脱以降低染料背景。普通实验可以省略。DNA染色4.1 用去离子水按100: 1的比例稀释试剂 F,制备适量1X Hoechst33342 反应液，避光保存；4.2 每孔加入100科L 1X Hoechst 33342反应液，避光、室温、脱色摇麻0缔钟后，弃染色反应液；4.3 每孔每次加入100科LL含BSI3次；4.4 客户可选择进行其他染色步骤，否则每孔加入10便待用L PBS其他染色（自备）（可选）客户可以根据实验需要进行细胞表面或细胞内抗原的抗体染色（注：染料兼容性请参照表4）。图像获取及分析建议染色完成后立即进行观测；如果条件限制，请避光4 C湿润保存待测，但不应超过 3天。注：调试仪器时，请将曝光时间调整为30ms左右，尽量不要1s 。表5配套染料的相关波长信息C00031*Apollo ? 567550 nm565 nmCy3C00041Apollo ? 643653 nm667 nmCy5C00033*Hoechst 33342350 nm461 nmDAPI注：1）*荧光显微镜宜采用 Hoechst 33342 及Apollo? 567进彳RNA复制活性检测;2）激光共聚焦显微镜采用Apollo? 567或pollo? 643 均可。