1、蛋白质（蛋白质（IIIIII）蛋白质的主要研究技术蛋白质的主要研究技术蛋白质的主要研究技术蛋白质的主要研究技术蛋白质的性质蛋白质的性质n nn胶体性质胶体性质胶体性质胶体性质胶体性质胶体性质n nn蛋白质分子直径在蛋白质分子直径在蛋白质分子直径在蛋白质分子直径在蛋白质分子直径在蛋白质分子直径在1100nm1100nm1100nm范围内范围内范围内范围内范围内范围内n nn透析：根据蛋白质分子大于一般小分子物质的特点，透析：根据蛋白质分子大于一般小分子物质的特点，透析：根据蛋白质分子大于一般小分子物质的特点，透析：根据蛋白质分子大于一般小分子物质的特点，透析：根据蛋白质分子大于一般小分子物质的特
2、点，透析：根据蛋白质分子大于一般小分子物质的特点，可以利用半透膜把蛋白质与小分子分开可以利用半透膜把蛋白质与小分子分开可以利用半透膜把蛋白质与小分子分开可以利用半透膜把蛋白质与小分子分开可以利用半透膜把蛋白质与小分子分开可以利用半透膜把蛋白质与小分子分开n nn丁达尔现象丁达尔现象丁达尔现象丁达尔现象丁达尔现象丁达尔现象n nn水化现象水化现象水化现象水化现象水化现象水化现象n nn吸附现象吸附现象吸附现象吸附现象吸附现象吸附现象n nn酸碱性质酸碱性质酸碱性质酸碱性质酸碱性质酸碱性质n nn等电点与电场迁移等电点与电场迁移等电点与电场迁移等电点与电场迁移等电点与电场迁移等电点与电场迁移n n
3、n蛋白质在等电点附近溶解性最小，电场中不迁移蛋白质在等电点附近溶解性最小，电场中不迁移蛋白质在等电点附近溶解性最小，电场中不迁移蛋白质在等电点附近溶解性最小，电场中不迁移蛋白质在等电点附近溶解性最小，电场中不迁移蛋白质在等电点附近溶解性最小，电场中不迁移n nn一般情况下，大分子蛋白质的等电点是不能直接利用一般情况下，大分子蛋白质的等电点是不能直接利用一般情况下，大分子蛋白质的等电点是不能直接利用一般情况下，大分子蛋白质的等电点是不能直接利用一般情况下，大分子蛋白质的等电点是不能直接利用一般情况下，大分子蛋白质的等电点是不能直接利用氨基酸侧链基团推算。氨基酸侧链基团推算。氨基酸侧链基团推算。氨
4、基酸侧链基团推算。氨基酸侧链基团推算。氨基酸侧链基团推算。n nn蛋白质的颜色反应（蛋白质的颜色反应（蛋白质的颜色反应（蛋白质的颜色反应（蛋白质的颜色反应（蛋白质的颜色反应（p35p35p35）n nn双缩脲反应：与双缩脲反应：与双缩脲反应：与双缩脲反应：与双缩脲反应：与双缩脲反应：与CuSOCuSOCuSO4 44碱性溶液反应，生成紫红色或蓝碱性溶液反应，生成紫红色或蓝碱性溶液反应，生成紫红色或蓝碱性溶液反应，生成紫红色或蓝碱性溶液反应，生成紫红色或蓝碱性溶液反应，生成紫红色或蓝紫色的复合物，紫色的复合物，紫色的复合物，紫色的复合物，紫色的复合物，紫色的复合物，540nm540nm540nm
5、处有最大光吸收。处有最大光吸收。处有最大光吸收。处有最大光吸收。处有最大光吸收。处有最大光吸收。n nn米伦反应：蛋白质与硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸、亚硝米伦反应：蛋白质与硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸、亚硝米伦反应：蛋白质与硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸、亚硝米伦反应：蛋白质与硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸、亚硝米伦反应：蛋白质与硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸、亚硝米伦反应：蛋白质与硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸、亚硝酸的混合液反应生成白色沉淀，加热后变为红色，这酸的混合液反应生成白色沉淀，加热后变为红色，这酸的混合液反应生成白色沉淀，加热后变为红色，这酸的混合液反应生成白色沉淀，加热后变为红色，这酸的混合液反应生成白色沉淀，加热后变
6、为红色，这酸的混合液反应生成白色沉淀，加热后变为红色，这是酚类化合物的反应（是酚类化合物的反应（是酚类化合物的反应（是酚类化合物的反应（是酚类化合物的反应（是酚类化合物的反应（TyrTyrTyr）n nn乙醛酸反应：蛋白质溶液加入乙醛酸，并沿试管壁慢乙醛酸反应：蛋白质溶液加入乙醛酸，并沿试管壁慢乙醛酸反应：蛋白质溶液加入乙醛酸，并沿试管壁慢乙醛酸反应：蛋白质溶液加入乙醛酸，并沿试管壁慢乙醛酸反应：蛋白质溶液加入乙醛酸，并沿试管壁慢乙醛酸反应：蛋白质溶液加入乙醛酸，并沿试管壁慢慢注入浓硫酸，两液层之间会出现紫色环，这是含吲慢注入浓硫酸，两液层之间会出现紫色环，这是含吲慢注入浓硫酸，两液层之间会出
7、现紫色环，这是含吲慢注入浓硫酸，两液层之间会出现紫色环，这是含吲慢注入浓硫酸，两液层之间会出现紫色环，这是含吲慢注入浓硫酸，两液层之间会出现紫色环，这是含吲哚基化合物的反应（哚基化合物的反应（哚基化合物的反应（哚基化合物的反应（哚基化合物的反应（哚基化合物的反应（TrpTrpTrp），明胶一般无此反应），明胶一般无此反应），明胶一般无此反应），明胶一般无此反应），明胶一般无此反应），明胶一般无此反应n nn坂口反应：蛋白质加入次氯酸、坂口反应：蛋白质加入次氯酸、坂口反应：蛋白质加入次氯酸、坂口反应：蛋白质加入次氯酸、坂口反应：蛋白质加入次氯酸、坂口反应：蛋白质加入次氯酸、-萘酚、氢氧化钠可萘酚
8、氢氧化钠可萘酚、氢氧化钠可萘酚、氢氧化钠可萘酚、氢氧化钠可萘酚、氢氧化钠可以生成红色化合物，胍基反应（以生成红色化合物，胍基反应（以生成红色化合物，胍基反应（以生成红色化合物，胍基反应（以生成红色化合物，胍基反应（以生成红色化合物，胍基反应（ArgArgArg）n nn酚试剂：福林（酚试剂：福林（酚试剂：福林（酚试剂：福林（酚试剂：福林（酚试剂：福林（FolinFolinFolin）试剂，酚基）试剂，酚基）试剂，酚基）试剂，酚基）试剂，酚基）试剂，酚基（TyrTyrTyr）可以把磷钼可以把磷钼可以把磷钼可以把磷钼可以把磷钼可以把磷钼酸、磷钨酸还原成蓝色化合物，酸、磷钨酸还原成蓝色化合物，酸、
9、磷钨酸还原成蓝色化合物，酸、磷钨酸还原成蓝色化合物，酸、磷钨酸还原成蓝色化合物，酸、磷钨酸还原成蓝色化合物，LowryLowryLowry法。法。法。法。法。法。n nn光吸收性质光吸收性质光吸收性质光吸收性质n nn蛋白质在蛋白质在蛋白质在蛋白质在蛋白质在蛋白质在280nm280nm280nm处有强烈的光吸收处有强烈的光吸收处有强烈的光吸收处有强烈的光吸收处有强烈的光吸收处有强烈的光吸收n nnPhePhePhe、TyrTyrTyr、TrpTrpTrpn nnTrpTrpTrp贡献最大贡献最大贡献最大贡献最大贡献最大贡献最大蛋白质的沉淀与变性蛋白质的沉淀与变性n nn沉淀作用沉淀作用沉淀作用
10、沉淀作用沉淀作用沉淀作用n nn蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关电荷和水化作用有关电荷和水化作用有关电荷和水化作用有关电荷和水化作用有关电荷和水化作用有关n nn改变溶液的条件将影响蛋白质的溶解性质，在适当的改变溶液的条件将影响蛋白质的溶解性质，在适当的改变溶液的条件将影响蛋白质的溶解性质，在适当的改变溶液的条件将影响蛋白质的溶解性质，
11、在适当的改变溶液的条件将影响蛋白质的溶解性质，在适当的改变溶液的条件将影响蛋白质的溶解性质，在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来n nn可逆沉淀可逆沉淀可逆沉淀可逆沉淀可逆沉淀可逆沉淀n nn在温和条件下，通过改变溶液的在温和条件下，通过改变溶液的在温和条件下，通过改变溶液的在温和条件下，通过改变溶液的在温和条件下，通过改变溶液的在温和条件下，通过改变溶液的pHpHpHpHpHpH或电荷状况，使蛋或电荷状况，使蛋或电荷状
12、况，使蛋或电荷状况，使蛋或电荷状况，使蛋或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。白质从胶体溶液中沉淀分离。白质从胶体溶液中沉淀分离。白质从胶体溶液中沉淀分离。白质从胶体溶液中沉淀分离。白质从胶体溶液中沉淀分离。n nn在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又的条件下，可
13、以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀称为非变性沉淀称为非变性沉淀称为非变性沉淀称为非变性沉淀称为非变性沉淀n nn可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法n nn根据蛋白质的不同溶解和沉淀性质将目标蛋白根据蛋白质的不同溶解和沉淀性质将目标蛋白根据蛋白质的不同溶解和沉淀性质将目标蛋白根据蛋白质的不同溶解和沉淀性质将目标蛋白根据蛋白质的不同溶解和沉
14、淀性质将目标蛋白根据蛋白质的不同溶解和沉淀性质将目标蛋白质和其他物质分开质和其他物质分开质和其他物质分开质和其他物质分开质和其他物质分开质和其他物质分开n nn等电点沉淀法：等电点沉淀法：等电点沉淀法：等电点沉淀法：等电点沉淀法：等电点沉淀法：n nn调整调整调整调整调整调整pHpHpHpHpHpH至对应蛋白质等电点，使其沉淀分离至对应蛋白质等电点，使其沉淀分离至对应蛋白质等电点，使其沉淀分离至对应蛋白质等电点，使其沉淀分离至对应蛋白质等电点，使其沉淀分离至对应蛋白质等电点，使其沉淀分离n nn适用于区分等电点差异大的亲水蛋白适用于区分等电点差异大的亲水蛋白适用于区分等电点差异大的亲水蛋白适用
15、于区分等电点差异大的亲水蛋白适用于区分等电点差异大的亲水蛋白适用于区分等电点差异大的亲水蛋白n nn盐析与盐溶法：盐析与盐溶法：盐析与盐溶法：盐析与盐溶法：盐析与盐溶法：盐析与盐溶法：n nn中性盐影响蛋白质溶解性的双向作用中性盐影响蛋白质溶解性的双向作用中性盐影响蛋白质溶解性的双向作用中性盐影响蛋白质溶解性的双向作用中性盐影响蛋白质溶解性的双向作用中性盐影响蛋白质溶解性的双向作用n nn常用盐析剂：常用盐析剂：常用盐析剂：常用盐析剂：常用盐析剂：常用盐析剂：MgClMgClMgCl2 22、（、（、（NHNHNH4 44）2 22SOSOSO4 44、K KK2 22SOSOSO4 44n
16、nn有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法n nn改变介质常数，破坏蛋白质胶体的水化作用改变介质常数，破坏蛋白质胶体的水化作用改变介质常数，破坏蛋白质胶体的水化作用改变介质常数，破坏蛋白质胶体的水化作用改变介质常数，破坏蛋白质胶体的水化作用改变介质常数，破坏蛋白质胶体的水化作用n nn常用丙酮、乙醇，结合低温和等电点共同沉淀蛋白质常用丙酮、乙醇，结合低温和等电点共同沉淀蛋白质常用丙酮、乙醇，结合低温和等电点共同沉淀蛋白质常用丙酮、乙醇，结合低温和等电点共同沉淀蛋白质常用丙酮、乙醇，结合低温和等电点共同沉淀蛋白质常用丙酮、乙醇，结合低温和等电点共同沉
17、淀蛋白质n nn不可逆沉淀不可逆沉淀不可逆沉淀不可逆沉淀n nn在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水质，产生的蛋白质
18、沉淀不可能再重新溶解于水质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水n nn由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀化，所以又称为变性沉淀化，所以又称为变性沉淀化，所以又称为变性沉淀化，所以又称为变性沉淀化，所以又称为变性沉淀n nn变性沉淀因素：变性沉淀因素：
19、变性沉淀因素：变性沉淀因素：变性沉淀因素：变性沉淀因素：n nn高温高温高温高温高温高温n nn强酸碱强酸碱强酸碱强酸碱强酸碱强酸碱n nn重金属盐重金属盐重金属盐重金属盐重金属盐重金属盐n nn有机试剂：溶剂、脲、胍、生物碱有机试剂：溶剂、脲、胍、生物碱有机试剂：溶剂、脲、胍、生物碱有机试剂：溶剂、脲、胍、生物碱有机试剂：溶剂、脲、胍、生物碱有机试剂：溶剂、脲、胍、生物碱n nn去垢剂：去垢剂：去垢剂：去垢剂：去垢剂：去垢剂：SDSSDSSDSSDSSDSSDS（十二烷基磺酸钠）（十二烷基磺酸钠）（十二烷基磺酸钠）（十二烷基磺酸钠）（十二烷基磺酸钠）（十二烷基磺酸钠）n nn变性后蛋白质化学
20、性质的改变变性后蛋白质化学性质的改变变性后蛋白质化学性质的改变变性后蛋白质化学性质的改变变性后蛋白质化学性质的改变变性后蛋白质化学性质的改变n nn生物活性丧失生物活性丧失生物活性丧失生物活性丧失生物活性丧失生物活性丧失n nn侧链基团暴露（颜色反应增强）侧链基团暴露（颜色反应增强）侧链基团暴露（颜色反应增强）侧链基团暴露（颜色反应增强）侧链基团暴露（颜色反应增强）侧链基团暴露（颜色反应增强）n nn物理化学性质改变：溶解性物理化学性质改变：溶解性物理化学性质改变：溶解性物理化学性质改变：溶解性物理化学性质改变：溶解性物理化学性质改变：溶解性 、粘度、粘度、粘度、粘度、粘度、粘度 、扩散系数、
21、扩散系数、扩散系数、扩散系数、扩散系数、扩散系数 n nn生物化学性质改变：易于酶解生物化学性质改变：易于酶解生物化学性质改变：易于酶解生物化学性质改变：易于酶解生物化学性质改变：易于酶解生物化学性质改变：易于酶解蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化n nn一般流程：一般流程：一般流程：一般流程：n nn前处理：前处理：前处理：前处理：前处理：前处理：n nn分离组织分离组织分离组织分离组织分离组织分离组织n nn破碎细胞破碎细胞破碎细胞破碎细胞破碎细胞破碎细胞n nn去其他组分去其他组分去其他组分去其他组分去其他组分去其他组分n nn注意问题：保持蛋白质的完整和活性注意问题：保持蛋白质的完整和活
22、性注意问题：保持蛋白质的完整和活性注意问题：保持蛋白质的完整和活性注意问题：保持蛋白质的完整和活性注意问题：保持蛋白质的完整和活性n nn常用方法常用方法常用方法常用方法常用方法常用方法n nn超声粉碎超声粉碎超声粉碎超声粉碎超声粉碎超声粉碎n nn微研磨微研磨微研磨微研磨微研磨微研磨n nn酶消化酶消化酶消化酶消化酶消化酶消化n nn超速离心超速离心超速离心超速离心超速离心超速离心n nn粗分级粗分级粗分级粗分级粗分级粗分级n nn常用方法：盐析法、等电沉淀、有机溶剂常用方法：盐析法、等电沉淀、有机溶剂常用方法：盐析法、等电沉淀、有机溶剂常用方法：盐析法、等电沉淀、有机溶剂常用方法：盐析法、
23、等电沉淀、有机溶剂常用方法：盐析法、等电沉淀、有机溶剂 n nn要求：简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能要求：简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能要求：简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能要求：简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能要求：简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能要求：简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能收缩蛋白质溶液收缩蛋白质溶液收缩蛋白质溶液收缩蛋白质溶液收缩蛋白质溶液收缩蛋白质溶液n nn细分级细分级细分级细分级细分级细分级n nn进一步提纯进一步提纯进一步提纯进一步提纯进一步提纯进一步提纯n nn常用方法：层析、电泳常用方法：层析、电泳常用方法：层析、电泳常用方法
24、层析、电泳常用方法：层析、电泳常用方法：层析、电泳n nn规模小，分辨率高规模小，分辨率高规模小，分辨率高规模小，分辨率高规模小，分辨率高规模小，分辨率高n nn结结结结结结 晶晶晶晶晶晶n nn只有纯度达到一定的程度，才能实现结晶只有纯度达到一定的程度，才能实现结晶只有纯度达到一定的程度，才能实现结晶只有纯度达到一定的程度，才能实现结晶只有纯度达到一定的程度，才能实现结晶只有纯度达到一定的程度，才能实现结晶n nn结晶不一定意味着蛋白质已提纯结晶不一定意味着蛋白质已提纯结晶不一定意味着蛋白质已提纯结晶不一定意味着蛋白质已提纯结晶不一定意味着蛋白质已提纯结晶不一定意味着蛋白质已提纯n nn本
25、身有一定提纯作用。本身有一定提纯作用。本身有一定提纯作用。本身有一定提纯作用。本身有一定提纯作用。本身有一定提纯作用。n nn蛋白质的纯度鉴定蛋白质的纯度鉴定蛋白质的纯度鉴定蛋白质的纯度鉴定n nn活性鉴定：酶、激素等可以用对应的生物活性活性鉴定：酶、激素等可以用对应的生物活性活性鉴定：酶、激素等可以用对应的生物活性活性鉴定：酶、激素等可以用对应的生物活性活性鉴定：酶、激素等可以用对应的生物活性活性鉴定：酶、激素等可以用对应的生物活性检测来确定纯度检测来确定纯度检测来确定纯度检测来确定纯度检测来确定纯度检测来确定纯度n nn抗原抗体效价法抗原抗体效价法抗原抗体效价法抗原抗体效价法抗原抗体效价法
26、抗原抗体效价法n nn电泳、层析、超离心等方法电泳、层析、超离心等方法电泳、层析、超离心等方法电泳、层析、超离心等方法电泳、层析、超离心等方法电泳、层析、超离心等方法n nn恒溶法：在严格控制的条件下，以加入的固体恒溶法：在严格控制的条件下，以加入的固体恒溶法：在严格控制的条件下，以加入的固体恒溶法：在严格控制的条件下，以加入的固体恒溶法：在严格控制的条件下，以加入的固体恒溶法：在严格控制的条件下，以加入的固体蛋白的量对溶解蛋白的量作图，可以确定是否蛋白的量对溶解蛋白的量作图，可以确定是否蛋白的量对溶解蛋白的量作图，可以确定是否蛋白的量对溶解蛋白的量作图，可以确定是否蛋白的量对溶解蛋白的量作图
27、可以确定是否蛋白的量对溶解蛋白的量作图，可以确定是否提纯。提纯。提纯。提纯。提纯。提纯。n nn根据纯化和鉴定的方式的不同，常把蛋白质的根据纯化和鉴定的方式的不同，常把蛋白质的根据纯化和鉴定的方式的不同，常把蛋白质的根据纯化和鉴定的方式的不同，常把蛋白质的根据纯化和鉴定的方式的不同，常把蛋白质的根据纯化和鉴定的方式的不同，常把蛋白质的纯度定义为：电泳纯、结晶纯、色谱纯等等纯度定义为：电泳纯、结晶纯、色谱纯等等纯度定义为：电泳纯、结晶纯、色谱纯等等纯度定义为：电泳纯、结晶纯、色谱纯等等纯度定义为：电泳纯、结晶纯、色谱纯等等纯度定义为：电泳纯、结晶纯、色谱纯等等蛋白质分离纯化常用技术蛋白质分离纯
28、化常用技术蛋白质分离纯化常用技术蛋白质分离纯化常用技术n nn沉降分离（沉降分离（沉降分离（沉降分离（沉降分离（沉降分离（SedimentationSedimentationSedimentation）n nn蛋白质分子量、形状的不同会产生密度和沉降速度的蛋白质分子量、形状的不同会产生密度和沉降速度的蛋白质分子量、形状的不同会产生密度和沉降速度的蛋白质分子量、形状的不同会产生密度和沉降速度的蛋白质分子量、形状的不同会产生密度和沉降速度的蛋白质分子量、形状的不同会产生密度和沉降速度的差异差异差异差异差异差异n nn差速离心：利用蛋白质分子在离心力场的作用下沉降差速离心：利用蛋白质分子在离心力场的
29、作用下沉降差速离心：利用蛋白质分子在离心力场的作用下沉降差速离心：利用蛋白质分子在离心力场的作用下沉降差速离心：利用蛋白质分子在离心力场的作用下沉降差速离心：利用蛋白质分子在离心力场的作用下沉降速度的差异分离不同蛋白质速度的差异分离不同蛋白质速度的差异分离不同蛋白质速度的差异分离不同蛋白质速度的差异分离不同蛋白质速度的差异分离不同蛋白质n nn单位离心力场下，物质的沉降速度与分子量和分子形状有关单位离心力场下，物质的沉降速度与分子量和分子形状有关单位离心力场下，物质的沉降速度与分子量和分子形状有关单位离心力场下，物质的沉降速度与分子量和分子形状有关单位离心力场下，物质的沉降速度与分子量和分子形
30、状有关单位离心力场下，物质的沉降速度与分子量和分子形状有关n nn在生物化学中常用沉降系数表征分子量在生物化学中常用沉降系数表征分子量在生物化学中常用沉降系数表征分子量在生物化学中常用沉降系数表征分子量在生物化学中常用沉降系数表征分子量在生物化学中常用沉降系数表征分子量n nn密度梯度离心密度梯度离心密度梯度离心密度梯度离心密度梯度离心密度梯度离心n nn利用物质在密度与其相同的溶液中不会沉降的特点区分不同密利用物质在密度与其相同的溶液中不会沉降的特点区分不同密利用物质在密度与其相同的溶液中不会沉降的特点区分不同密利用物质在密度与其相同的溶液中不会沉降的特点区分不同密利用物质在密度与其相同的溶
31、液中不会沉降的特点区分不同密利用物质在密度与其相同的溶液中不会沉降的特点区分不同密度的物质度的物质度的物质度的物质度的物质度的物质n nn常用蔗糖，常用蔗糖，常用蔗糖，常用蔗糖，常用蔗糖，常用蔗糖，CSClCSClCSCl等构建等构建等构建等构建等构建等构建n nn层析、色谱（层析、色谱（层析、色谱（层析、色谱（ChromatographyChromatography）n nn分配层析分配层析分配层析分配层析分配层析分配层析n nn一般原理：利用待分离物质在流动相和固定相中分一般原理：利用待分离物质在流动相和固定相中分一般原理：利用待分离物质在流动相和固定相中分一般原理：利用待分离物质在流动相
32、和固定相中分一般原理：利用待分离物质在流动相和固定相中分一般原理：利用待分离物质在流动相和固定相中分配系数的不同，使物质间出现移动速度的差异，从配系数的不同，使物质间出现移动速度的差异，从配系数的不同，使物质间出现移动速度的差异，从配系数的不同，使物质间出现移动速度的差异，从配系数的不同，使物质间出现移动速度的差异，从配系数的不同，使物质间出现移动速度的差异，从而区分不同的物质。而区分不同的物质。而区分不同的物质。而区分不同的物质。而区分不同的物质。而区分不同的物质。n nn常用方式：常用方式：常用方式：常用方式：常用方式：常用方式：n nn分配柱层析分配柱层析分配柱层析分配柱层析分配柱层析分
33、配柱层析n nn滤纸层析滤纸层析滤纸层析滤纸层析滤纸层析滤纸层析n nn薄层层析薄层层析薄层层析薄层层析薄层层析薄层层析n nn离子交换层析离子交换层析离子交换层析离子交换层析离子交换层析离子交换层析n nn气相色谱气相色谱气相色谱气相色谱气相色谱气相色谱n nn高效液相色谱（高效液相色谱（高效液相色谱（高效液相色谱（高效液相色谱（高效液相色谱（HPLCHPLCHPLC）n nn利用非常细的颗粒固相支持剂，提高分配表面积利用非常细的颗粒固相支持剂，提高分配表面积利用非常细的颗粒固相支持剂，提高分配表面积利用非常细的颗粒固相支持剂，提高分配表面积利用非常细的颗粒固相支持剂，提高分配表面积利用非常
34、细的颗粒固相支持剂，提高分配表面积n nn溶剂系统采用高压，提高系统速度溶剂系统采用高压，提高系统速度溶剂系统采用高压，提高系统速度溶剂系统采用高压，提高系统速度溶剂系统采用高压，提高系统速度溶剂系统采用高压，提高系统速度n nn离子交换层析离子交换层析离子交换层析离子交换层析离子交换层析离子交换层析n nn原理：原理：原理：原理：原理：原理：n nn利用不同离子在不同的利用不同离子在不同的利用不同离子在不同的利用不同离子在不同的利用不同离子在不同的利用不同离子在不同的pHpHpH下与固定相结合强度的差异，使下与固定相结合强度的差异，使下与固定相结合强度的差异，使下与固定相结合强度的差异，使下
35、与固定相结合强度的差异，使下与固定相结合强度的差异，使待分离的物质在特定条件下与固定相中的同型离子发生交待分离的物质在特定条件下与固定相中的同型离子发生交待分离的物质在特定条件下与固定相中的同型离子发生交待分离的物质在特定条件下与固定相中的同型离子发生交待分离的物质在特定条件下与固定相中的同型离子发生交待分离的物质在特定条件下与固定相中的同型离子发生交换，而与固定相结合，从而区分不同物质换，而与固定相结合，从而区分不同物质换，而与固定相结合，从而区分不同物质换，而与固定相结合，从而区分不同物质换，而与固定相结合，从而区分不同物质换，而与固定相结合，从而区分不同物质n nn可分为：可分为：可分为
36、可分为：可分为：可分为：n nn阳离子交换柱：强酸型、弱酸型阳离子交换柱：强酸型、弱酸型阳离子交换柱：强酸型、弱酸型阳离子交换柱：强酸型、弱酸型阳离子交换柱：强酸型、弱酸型阳离子交换柱：强酸型、弱酸型n nn阴离子交换柱：强碱型、弱碱型阴离子交换柱：强碱型、弱碱型阴离子交换柱：强碱型、弱碱型阴离子交换柱：强碱型、弱碱型阴离子交换柱：强碱型、弱碱型阴离子交换柱：强碱型、弱碱型n nn常用介质：常用介质：常用介质：常用介质：常用介质：常用介质：n nn聚苯乙烯聚苯乙烯聚苯乙烯聚苯乙烯聚苯乙烯聚苯乙烯-苯二乙烯树脂苯二乙烯树脂苯二乙烯树脂苯二乙烯树脂苯二乙烯树脂苯二乙烯树脂n nn离子交换纤维素离
37、子交换纤维素离子交换纤维素离子交换纤维素离子交换纤维素离子交换纤维素n nn离子交换葡聚糖离子交换葡聚糖离子交换葡聚糖离子交换葡聚糖离子交换葡聚糖离子交换葡聚糖n nn洗脱方式洗脱方式洗脱方式洗脱方式洗脱方式洗脱方式n nn分段洗脱分段洗脱分段洗脱分段洗脱分段洗脱分段洗脱n nn梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱n nn分子排阻层析（分子排阻层析（分子排阻层析（分子排阻层析（分子排阻层析（分子排阻层析（molecular-exclusionmolecular-exclusionmolecular-exclusion ChromatographyChromatographyChro
38、matography）n nn原理：利用具有不同孔径的多孔网状结构的凝胶珠作为原理：利用具有不同孔径的多孔网状结构的凝胶珠作为原理：利用具有不同孔径的多孔网状结构的凝胶珠作为原理：利用具有不同孔径的多孔网状结构的凝胶珠作为原理：利用具有不同孔径的多孔网状结构的凝胶珠作为原理：利用具有不同孔径的多孔网状结构的凝胶珠作为分离介质，小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被分离介质，小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被分离介质，小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被分离介质，小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被分离介质，小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被分离介质，小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内
39、部而被滞留；大分子被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速滞留；大分子被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速滞留；大分子被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速滞留；大分子被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速滞留；大分子被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速滞留；大分子被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。又称凝胶过滤、分子筛通过。又称凝胶过滤、分子筛通过。又称凝胶过滤、分子筛通过。又称凝胶过滤、分子筛通过。又称凝胶过滤、分子筛通过。又称凝胶过滤、分子筛n nn一般步骤一般步骤一般步骤一般步骤一般步骤一般步骤n nn柱平衡柱平衡柱平衡柱平衡柱平衡柱平衡n nn蛋白质混合物上柱蛋白质混合物上柱蛋白质混合
40、物上柱蛋白质混合物上柱蛋白质混合物上柱蛋白质混合物上柱 n nn洗脱液洗脱蛋白洗脱液洗脱蛋白洗脱液洗脱蛋白洗脱液洗脱蛋白洗脱液洗脱蛋白洗脱液洗脱蛋白n nn收集记录收集记录收集记录收集记录收集记录收集记录n nn可以用于分析分子量可以用于分析分子量可以用于分析分子量可以用于分析分子量可以用于分析分子量可以用于分析分子量n nn分子量与洗脱体积相关分子量与洗脱体积相关分子量与洗脱体积相关分子量与洗脱体积相关分子量与洗脱体积相关分子量与洗脱体积相关n nn排阻极限：表示分级范围的上限，不能扩散进入凝胶珠微孔的排阻极限：表示分级范围的上限，不能扩散进入凝胶珠微孔的排阻极限：表示分级范围的上限，不能扩
41、散进入凝胶珠微孔的排阻极限：表示分级范围的上限，不能扩散进入凝胶珠微孔的排阻极限：表示分级范围的上限，不能扩散进入凝胶珠微孔的排阻极限：表示分级范围的上限，不能扩散进入凝胶珠微孔的最小分子的分子量最小分子的分子量最小分子的分子量最小分子的分子量最小分子的分子量最小分子的分子量 n nn亲和层析（亲和层析（亲和层析（亲和层析（亲和层析（亲和层析（Affinity chromatographyAffinity chromatography）n nn原理：利用待分离蛋白质与固定相中相应配体的特原理：利用待分离蛋白质与固定相中相应配体的特原理：利用待分离蛋白质与固定相中相应配体的特原理：利用待分离蛋白
42、质与固定相中相应配体的特原理：利用待分离蛋白质与固定相中相应配体的特原理：利用待分离蛋白质与固定相中相应配体的特异性结合，将目标蛋白质与其他物质分开异性结合，将目标蛋白质与其他物质分开异性结合，将目标蛋白质与其他物质分开异性结合，将目标蛋白质与其他物质分开异性结合，将目标蛋白质与其他物质分开异性结合，将目标蛋白质与其他物质分开n nn一般步骤一般步骤一般步骤一般步骤一般步骤一般步骤n nn制备交联有配体的层析柱制备交联有配体的层析柱制备交联有配体的层析柱制备交联有配体的层析柱制备交联有配体的层析柱制备交联有配体的层析柱n nn蛋白质上样，平衡蛋白质上样，平衡蛋白质上样，平衡蛋白质上样，平衡蛋白
43、质上样，平衡蛋白质上样，平衡n nn杂质洗脱杂质洗脱杂质洗脱杂质洗脱杂质洗脱杂质洗脱n nn可溶性配体洗脱目标蛋白质可溶性配体洗脱目标蛋白质可溶性配体洗脱目标蛋白质可溶性配体洗脱目标蛋白质可溶性配体洗脱目标蛋白质可溶性配体洗脱目标蛋白质n nn电电电电 泳（泳（泳（泳（elecctrophoresiselecctrophoresis）n nn在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处于等电状态在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处于等电状态在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处于等电状态在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处于等电状态在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处于等电状态在外电场的作用下，带电颗粒
44、例如不处于等电状态的蛋白质分子，将向着与其电性相反的电极移动，这的蛋白质分子，将向着与其电性相反的电极移动，这的蛋白质分子，将向着与其电性相反的电极移动，这的蛋白质分子，将向着与其电性相反的电极移动，这的蛋白质分子，将向着与其电性相反的电极移动，这的蛋白质分子，将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称电泳种现象称电泳种现象称电泳种现象称电泳种现象称电泳种现象称电泳n nn电泳的基本原理：相同分子，有相同的电泳迁移率电泳的基本原理：相同分子，有相同的电泳迁移率电泳的基本原理：相同分子，有相同的电泳迁移率电泳的基本原理：相同分子，有相同的电泳迁移率电泳的基本原理：相同分子，有相同的电泳迁移率电泳
45、的基本原理：相同分子，有相同的电泳迁移率n nn常见电泳形式：常见电泳形式：常见电泳形式：常见电泳形式：常见电泳形式：常见电泳形式：n nn界面移动电泳：界面移动电泳：界面移动电泳：界面移动电泳：界面移动电泳：界面移动电泳：n nn在在在在在在U UU型管中使蛋白质溶液与缓冲液形成清晰液面，利用电型管中使蛋白质溶液与缓冲液形成清晰液面，利用电型管中使蛋白质溶液与缓冲液形成清晰液面，利用电型管中使蛋白质溶液与缓冲液形成清晰液面，利用电型管中使蛋白质溶液与缓冲液形成清晰液面，利用电型管中使蛋白质溶液与缓冲液形成清晰液面，利用电泳过程中液面的移动来记录电泳结果泳过程中液面的移动来记录电泳结果泳过程中
46、液面的移动来记录电泳结果泳过程中液面的移动来记录电泳结果泳过程中液面的移动来记录电泳结果泳过程中液面的移动来记录电泳结果n nn血浆电泳、毛细管电泳都属于这一类血浆电泳、毛细管电泳都属于这一类血浆电泳、毛细管电泳都属于这一类血浆电泳、毛细管电泳都属于这一类血浆电泳、毛细管电泳都属于这一类血浆电泳、毛细管电泳都属于这一类n nn区带电泳：区带电泳：区带电泳：区带电泳：区带电泳：区带电泳：n nn在固定的支持物上进行电泳，各组分因迁移率不同，形成在固定的支持物上进行电泳，各组分因迁移率不同，形成在固定的支持物上进行电泳，各组分因迁移率不同，形成在固定的支持物上进行电泳，各组分因迁移率不同，形成在固
47、定的支持物上进行电泳，各组分因迁移率不同，形成在固定的支持物上进行电泳，各组分因迁移率不同，形成不同区带，可以区分不同蛋白质不同区带，可以区分不同蛋白质不同区带，可以区分不同蛋白质不同区带，可以区分不同蛋白质不同区带，可以区分不同蛋白质不同区带，可以区分不同蛋白质n nn滤纸电泳、薄膜电泳、涂层电泳、微介质电泳、凝胶电泳滤纸电泳、薄膜电泳、涂层电泳、微介质电泳、凝胶电泳滤纸电泳、薄膜电泳、涂层电泳、微介质电泳、凝胶电泳滤纸电泳、薄膜电泳、涂层电泳、微介质电泳、凝胶电泳滤纸电泳、薄膜电泳、涂层电泳、微介质电泳、凝胶电泳滤纸电泳、薄膜电泳、涂层电泳、微介质电泳、凝胶电泳n nnSDS-SDS-SD
48、S-盘式凝胶电泳：盘式凝胶电泳：盘式凝胶电泳：盘式凝胶电泳：盘式凝胶电泳：盘式凝胶电泳：n nn用聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，可以将凝胶分别作成浓缩用聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，可以将凝胶分别作成浓缩用聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，可以将凝胶分别作成浓缩用聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，可以将凝胶分别作成浓缩用聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，可以将凝胶分别作成浓缩用聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，可以将凝胶分别作成浓缩胶和分离胶两部分胶和分离胶两部分胶和分离胶两部分胶和分离胶两部分胶和分离胶两部分胶和分离胶两部分.n nn浓缩胶一般孔径较大，浓缩胶一般孔径较大，浓缩胶一般孔径较大，浓缩胶一般孔径较大，浓缩胶一般孔径较大
49、浓缩胶一般孔径较大，pH6.8pH6.8pH6.8，分离胶一般孔径较小，分离胶一般孔径较小，分离胶一般孔径较小，分离胶一般孔径较小，分离胶一般孔径较小，分离胶一般孔径较小，pH8.8pH8.8pH8.8n nn样本加入样本加入样本加入样本加入样本加入样本加入SDSSDSSDS（十二烷基磺酸钠）、巯基乙醇、尿素处理，（十二烷基磺酸钠）、巯基乙醇、尿素处理，（十二烷基磺酸钠）、巯基乙醇、尿素处理，（十二烷基磺酸钠）、巯基乙醇、尿素处理，（十二烷基磺酸钠）、巯基乙醇、尿素处理，（十二烷基磺酸钠）、巯基乙醇、尿素处理，使蛋白质分子带上均匀的负电荷，分子形状变为一致的杆使蛋白质分子带上均匀的负电荷，分
50、子形状变为一致的杆使蛋白质分子带上均匀的负电荷，分子形状变为一致的杆使蛋白质分子带上均匀的负电荷，分子形状变为一致的杆使蛋白质分子带上均匀的负电荷，分子形状变为一致的杆使蛋白质分子带上均匀的负电荷，分子形状变为一致的杆状分子，消除电荷差异和分子形态差异的影响。状分子，消除电荷差异和分子形态差异的影响。状分子，消除电荷差异和分子形态差异的影响。状分子，消除电荷差异和分子形态差异的影响。状分子，消除电荷差异和分子形态差异的影响。状分子，消除电荷差异和分子形态差异的影响。n nn具有：具有：具有：具有：具有：具有：样品的浓缩效应样品的浓缩效应样品的浓缩效应样品的浓缩效应样品的浓缩效应样品的浓缩效应
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