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1、16SrRNA 基因序列分析法鉴定病原细菌朱飞舟1，陈利玉2，田奇3，谈成3，欧阳方丹1，陈汉春1，吴正理1（1. 中南大学生物科学与技术学院生物化学系，长沙 410013；2. 中南大学湘雅医学院微生物学系，长沙 410078；3. 中南大学生物科学与技术学院，长沙 410013）摘要：目的 运用 16S rRNA 基因序列分析法鉴定 14 种临床上常见的病原细菌，为该方法的 临床应用奠定基础。方法 提取病原细菌的 DNA，采用通用引物经 PCR 扩增 16S rRNA 基因片 段，再测序扩增片段。将测序结果用 Blastn 在线软件在 Nucleotide 数据库中进行同源性比对，根据序列
2、同源性鉴定病原细菌。结果 12 种病原细菌可以鉴定到“种”，2 种病原细菌可以鉴定到“属”。结论 16S rRNA 基因序列分析是一种有用的病原细菌鉴定方法。关键词：病原细菌；16S rRNA；基因序列分析中图分类号：R3Identification of Pathogenic Microorganisms by Sequencing 16S rRNA GeneZhu Feizhou1, Chen Liyu2, Tian Qi3, Tan Cheng3, OuYang Fangdan1,Chen Hanchun1, Wu Zhengli1(1. Department of Biochemist
3、ry, School of Biological Science and Technology, Central SouthUniversity, ChangSha 410013;2. Department of Microbiology, Xiangya School of Medicine, Central South University, ChangSha 410078;3. School of Biological Science and Technology, Central South University, ChangSha 410013)Abstract: Objective
4、 To identify 14 kinds of common pathogenic microorganisms by sequencing 16S rRNA gene for establishing the basis of clinical use of this method. Methods DNA samples of the pathogenic microorganisms were extracted. The 16S rRNA genes were amplified by PCR and sequenced with the common primers. The se
5、quences of the 16S rRNA genes were aligned by using online software Blastn in Nucleotide database. The pathogenic microorganisms were identified according to the homology of their 16S rRNA genes. Results 12 kinds of pathogenic microorganisms could be identified to species. 2 kinds of pathogenic micr
6、oorganisms could be identified to genus. Conclusions 16S rRNA gene sequence analysis has been demonstrated a useful method for identifying pathogenic microorganisms.Keywords:16S rRNA; pathogenic microorganism; gene sequence analysis病原细菌的鉴定是临床细菌学的一项基本工作。鉴定病原细菌有多种方法，如形态学观 察、血清分型、生化分析、遗传学分析等。遗传学分析法有基因序
7、列分析、分子标记检测、 核酸分子杂交等1。遗传学分析的候选基因主要有 16S rRNA、23S rRNA、16-23S rRNA 间 隔区、gyrB（DNA 促旋酶 B）、rpoB（RNA 聚合酶的亚基）、sod（超氧化物歧化酶）基 因等1,2,3，应用最多的是 16S rRNA 基因。分子标记法包括 RAPD（random amplified polymorphic DNA, 随机扩增多态性 DNA ） , AFLP （ amplified fragment lengt h polymorphis m, 扩增片段长度多 态性）, REP-PCR （REP 全称为 repetitive ext
8、ragenic palindromics, 重复基因外回文序列）1,4。目前，临床上通常采用表型观察和生化分析鉴定病原细菌，较少采用遗传学分析法。本基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金资助新教师基金课题（项目编号 20090162120028）；湖南省 科技计划（项目编号 2009SK3192）作者简介：朱飞舟，（1974-），男，讲师，主要研究方向：基因结构与功能通信联系人：吴正理，（1978-），男，讲师，主要研究方向：宏基因组学. E-mail: hundred_chenyahoo 研究运用 16S rRNA 基因序列分析法鉴定了 14 种临床上常见的病原细菌，旨在为临床病原 细菌的
9、遗传学鉴定奠定基础。1 材料与方法1.1 病原细菌病原细菌由中南大学基础医学院微生物学系提供，分别为大肠埃希菌、伤寒沙门菌、志 贺菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、变形杆菌、粘质沙雷菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆 菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和白色葡萄球菌。1.2 细菌基因组 DNA 提取 CTAB(Hexadecyl trimethyl ammonium Bromi de, 十六烷基三甲基溴化铵)法提 取细菌基因组 DNA。接种菌株于 LB 液体培养基，37震荡培养过夜。次日，取 1.5ml 新鲜 培养物，12,000g 离心 2min。去上清液，加入 567 l
10、TE 缓冲液，震荡悬浮细菌。然后，加 入 30l 10%SDS 和 15l 20mg/ml 蛋白酶 K（格兰氏阳性菌需先加入 20l 10mg/ml 溶菌酶，37反应 15min 后再加入蛋白酶 K），混匀，于 37温育 1hr，其间多次颠倒混匀。如果溶 液变澄清，表明细菌裂解完全。随后，加入 100l 5mole/L NaCl 和 80l CTAB/NaCl 溶液（5g CTAB 溶于 100ml 0.5mole/L 的 NaCl 溶液中，加热至 65使之溶解，室温保存），混匀，65温育 10min。可见白色的蛋白质沉淀。然后加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）， 混匀至乳浊状。1
11、2,000g 离心 5min，转上清液至一洁净试管，加入与上清液等体积的异丙醇， 轻轻混匀，直至产生絮状 DNA 沉淀。12,000g 离心 5min，去上清液，沉淀用 1ml 的 70%乙 醇洗涤。离心，弃乙醇，在洁净工作台中干燥沉淀。将沉淀溶于 50l TE 缓冲液，加入 1l RNase A(10mg/ml)，4储存备用。1.2.2 丙酮快速提取法。取新鲜细菌悬液，加入等体积丙酮，置于沸水浴中煮沸 10min。 然后 12,000g 离心 2min，其上清液即为细菌 DNA 溶液，可以用作 PCR 扩增的模板。1.3 PCR 扩增 16S rRNA 片段选取通用引物 27F 和 1492
12、R 作为 16S rRNA 基因片段的扩增引物。正向引物 27F 的序列 为 5-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3，反向引物 1492R 的序列为 5-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3。建立 50l 的 PCR 反应体系：DNA 模板 1l，ddH2O l，10*PCR 缓冲液(+KCl) 5l，25mmole/L MgCl2 2l，10mmole/L dNTP 1l，20mole/L 27F 引物 1l，20mole/L 1492R 引物 1l，5U/l Taq DNA 聚合酶酶 l，覆盖 50l 矿物油防止蒸发。采 用 Biometra P
13、ersonal Cycler PCR 仪扩增，PCR 反应程序为 94变性 5min 后于 94变性45sec、55退火 45sec、72延伸 90sec，30 个循环后于 72延伸 7min。4储存备用。1.4 PCR 产物序列分析扩增的细菌 16S rRNA 基因的 PCR 产物具有高度特异性，测序前无需纯化即可直接测 序。测序引物为 27F 和 1492R 序列，正、反测序（北京诺赛基因组研究中心完成）。1.5 序列同源性比对和进化树构建取各病原细菌 16S rRNA 基因片段测序图的中间部分 1380bp 片段序列进行同源性分析。1.5.1 将序列导入美国 NCBI 网站（ :/ nc
14、bi.nlm.nih.gov）的 Blastn 在线软件，选 择 Nucleotide Collection(nr/nt)数据库，运行 Blastn 程序，获取 16S rRNA 基因序列同源性最高的菌群。1.5.2 将序列导入 ClustalX(1.86) 软件，在菜单中选择 Alignment-Do CompleteAlignment，即得 14 种细菌的 16S rRNA 基因序列同源性比对图和进化树。2 结果2.1 16S rRNA 基因序列分析法鉴定病原细菌分别采用 CTAB 法和丙酮快速提取法提取细菌基因组 DNA。比较分析表明，CTAB 法 和丙酮快速提取法提取的 DNA 均可用
15、作 PCR 扩增的模板，但丙酮快速提取法快速、简单、 易行，更适用于临床应用。27F 和 1492R 引物的通用性好，可以扩增 14 种细菌的 16S rRNA 基因片段，扩增片段大小约为 1450bp；扩增的特异性很好，未见非特异性扩增产物，PCR 产物无需纯化即可用于序列分析（图 1）。图 1 病原细菌的 16S rRNA 基因 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳Fig. 1 Agarose gel electroforesis of PCR products from 16S rRNA gene of pathogenic microorganisms注：M:DNA 分子量标志；1:无模板空白对
16、照；2:大肠埃希菌；3:伤寒沙门菌；4:志贺菌；5:阴沟肠杆菌；6:肺炎克雷伯菌；7:变形杆菌；8:粘质沙雷菌；9:铜绿假单胞菌；10:鲍曼不动杆菌；11:枯草芽孢 杆菌；12:蜡样芽孢杆菌；13:金黄色葡萄球菌；14:表皮葡萄球菌；15:白色葡萄球菌。以 14 种细菌的 16S rRNA 基因 PCR 扩增片段为模板，采用引物 27F 和 1492R 序列进行 正、反向测序，其测序图谱的反应峰值高，信号强，无套峰（结果未显示）。取测序所得的14 种病原细菌 16S rRNA 基因 1380bp 片段的序列，导入美国 NCBI 网站的 Blastn 在线软件 进行序列比对，取序列同源性最高的细
17、菌作为鉴定结果。例如，取测序所得的金黄色葡萄球 菌 16S rRNA 基因 1380bp 片段序列，经在线软件 Blastn 中比对后，选择 Taxonomy Reports， 即可得到具有同源序列的细菌，以同源性从高到低的顺序从上向下排列；结果中 Max score(最大分值)表示序列同源性的大小，分值越大，表示同源性越高；E 值表示统计学显著 性，E 值越小，表示显著性越大5。图 2 显示金黄色葡萄球菌 16S rRNA 基因序列比对分析 结果。图 2 金黄色葡萄球菌 16S rRNA 基因序列比对分析Fig. 2 Alignments of 16S rRNA genes from Sta
18、phyloccocus aureus Rosenbach表 1 所示结果表明，16S rRNA 基因序列分析法鉴定的结果与菌种保存单位提供的结果 基本一致。两者相比，14 种菌在“属”的层次上完全一致；8 种菌在“种”的层次上一致， 如大肠埃希菌、肠道沙门菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、粘质沙雷菌、鲍曼不动杆菌、 铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌；3 种菌保存单位只鉴定到“属”，但 16S rRNA 序列分析 法可鉴定到“种”，如福氏志贺菌、奇异变形杆菌、科氏葡萄球菌；2 种菌 16S rRNA 序列 分析法只可鉴定到“属”，但菌种保存单位鉴定到了“种”，如枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆 菌；有 1 种菌
19、两者鉴定结果“属”名一致，“种”名不同，菌种保存单位鉴定的结果是表皮 葡萄球菌，而 16S rRNA 基因序列分析法鉴定提示为溶血性葡萄球菌。菌种保存单位表 1 16S rRNA 基因序列分析法鉴定结果16S rRNA 基因序列分析法鉴定结果两者结果比较提供的菌名 英文名 中文名大肠埃希菌 Escherichia coli 大肠埃希菌 “种”一致 伤寒沙门菌 Salmonella enterica 肠道沙门菌 “种”一致志贺菌 Shigella flexneri 福氏志贺菌 “属”相同，16S rRNA 基因序列分析法可鉴定到“种”阴沟肠杆菌 Enterobacter cloacae 阴沟肠杆
20、菌 “种”一致肺炎克雷伯菌 Klebsiellapneumoniae肺炎克雷伯菌 “种”一致变形杆菌 Proteus mirabilis 奇异变形杆菌 “属”相同，16S rRNA 基 因序列分析法可鉴定到“种”粘质沙雷菌 Serratiamar cescens铜绿假单胞菌 Pseudomonasaeruginosa鲍曼不动杆菌 Acinetobacterbaumannii粘质沙雷菌 “种”一致铜绿假单胞菌 “种”一致 鲍曼不动杆菌 “种”一致枯草芽孢杆菌 Bacillus 芽孢杆菌属 “属”相同蜡样芽孢杆菌 Bacillus 芽孢杆菌属 “属”相同金黄色葡萄球菌 Staphylococcus
21、aureus表皮葡萄球菌 Staphylococcushominis白色葡萄球菌 Staphylococcuscohnii金黄色葡萄球菌 “种”一致溶血性葡萄球菌 “属”相同，“种”不同 科氏葡萄球菌 “属”相同，16S rRNA 基因序列分析法可鉴定到“种”2.2 14 种病原细菌 16S rRNA 基因序列同源性和进化关系分析14 种病原细菌 16S rRNA 基因片段序列比对结果表明，16S rRNA 基因中存在保守区和 多态区，保守区如 225-276bp、429-450bp 等区段，多态区如 363-396bp 区段（图 3）。利用 保守区设计通用引物，可以扩增多种细菌的 16S r
22、RNA 基因片段；利用多态区序列可以区分 不同“种”细菌。另外，16S rRNA 基因序列分析可以判别不同“种”细菌间的亲缘关系， 在细菌的进化和分类分析中具有广泛应用前景（图 4）。图 3 14 种病原细菌 16S rRNA 基因序列比对Fig. 3 Alignments of 16S rRNA genes from 14 pathogenic microorganisms图 4 基于 16S rRNA 基因序列的 14 种病原细菌进化关系Fig. 4 Evolution relationships of 14 pathogenic microorganisms based on the 1
23、6S rRNA gene sequences3 讨论与结论可以通过表现型和基因型两条途径鉴定细菌。很明显，基因型比表现型更加稳定。目前 临床上应用的生化分析法属于表现型鉴定，该法依赖于细菌基因的特定表达产物。但基因表 达水平受环境因素的影响，故其鉴定过程存在较多不确定因素。比较而言，基因型的鉴定则 更加稳定，受环境因素影响较小6,7。因此，本文建立的 16S rRNA 基因序列分析法较生化分析法更加稳定，且重复性更好。另外，生化分析法只能鉴定特定病原细菌，而 16S rRNA 基 因序列分析法可以鉴定几乎所有的病原细菌。因此，16S rRNA 基因序列分析法具有稳定性 好、特异性强、费用低、效
24、率高等特点，具有潜在的临床实用价值。参考文献 (References)1 徐建国，梁国栋，邢来君，等译.（美）P.R.默里，E.J.巴伦，M.A.法勒，等著.临床微生物学手册M. 北 京，科学出版社，2005. 3353522 Hoffmann M, Brown E W, Feng P C, et al. PCR-based method for targeting 16S-23S rRNA intergenic spacer regions among Vibrio speciesJ. BMC Microbiology, 2010, 10:903 杨玲玲，职晓阳，李文均. 拟诺卡氏菌 16S
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