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1、分子生物学实验常用工具酶总 结作者:日期:现代分子生物学实验手册工具酶基因工程：在人工可以控制条件下，将基因剪切或重新组合，再导入另一生 物体内，使这些基因在其中表达并遗传下去的一门技术。核心:对基因进行人工切割、连接和重新组合，构建重组D NA。工具酶:在基因工程的重组DNA过程中，所需要用到的酶的统称。一、限制性内切酶（restri c t ion endonuclease）主要功能：对外源性的双链D NA进行切割、水解，不允许外源性D NA存在 于细菌自身细胞内。 （这种酶能对在自身细胞内存在的 DNA种类给予限制一 限制性内切酶）限制-修饰系统：合成限制性内切酶的细胞，其自身的D NA
2、不受酶的切割，这 是因为细菌细胞还会合成一种修饰酶，可以对自身DNA进行修饰，即改变D NA 原来具有的可以被限制性内切酶识别的核酸顺序结构，从而不被限制性内切酶识别及切割、水解。保护自身遗传物质稳定的机制。限制性内切酶：从原核生物中发现的，约60 0种，可识别108种不同的特定 DNA顺序。以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键， 产生DNA片段的5端为 P,3端为-?OH。命名：获得该酶的细菌属名的第一个字母（大写 ）+该菌种名的前两个字母 （小写）+株系的字母（小写）或数字+罗马数字（同一株菌种不同内切酶的编号） 例：细菌属名细菌种名菌株名称限制酶名称Arthrob a cterlu t e
3、u sA 1 u IEsch erich i acoliRY13EcoR iB a c i 1 lusamy 1 o 1 iqu e f acie nsHH a mH IHaemop h ilusinflue n zaeRdHind III（一）三种常用内切酶1. I型限制性内切酶同时兼有切割DNA的功能和修饰酶的修饰功能。在酶的识别位点上，若DNA两条链菌没有发生甲基化，则行使内切酶的功能 对DNA进行切割，同时转变成 ATP酶。若DNA双链中有一条链已发生甲基 化，则此类酶显示修饰酶的作用，对另一条 DNA进行甲基化修饰，然后在行切割 功能。 （实际上，有内切酶、修饰酶、ATP酶及解旋酶四
4、种功能）I型限制性内切酶在DNA链上的识别位点和切割位点不一致，也不固定。 没有时间应用价值。DNA甲基化：DN A化学修饰的一种形式，能在不改变 DNA序列的前提下，改 变遗传表现（外遗传机制）。多发生于CpG二核昔序列上（在甲基转移酶的催化下，DN A的CG两个核甘酸中的胞喀呢被选择性添加甲基 ，形成5-甲基胞喀 噬）。甲基化位点可随DNA的复制而遗传（D NA复制后，甲基化酶可将新和成的未甲基化的位点进行甲基化）。 DNA甲基化可引起基因组中相应区域染色质结构变化，使DNA 失去限制性内切酶的切割位点，以及DNA酶的 敏感位点,使染色质高度螺旋化，凝缩成团，失去转录活性。】 2. III
5、型限制性内切酶具有内切酶和甲基化修饰酶作用。具有专一的识别顺序，其切割位点在识别顺序旁边的几个核甘酸对的固定位 置上。（可识别短的不对称序列，切割位点与识别序列约距2426bp） 3.II型限制性内切酶也具有限制-修饰系统，但由限制酶和修饰酶这两种不同的酶共同来执行 这一系统的功能。即I I型限制性内切酶有在识别位点的切割功能，而不具备甲基 化修饰活性，修饰作用由相应的修饰酶完成。两种酶识别同一DN A特定序列，却发挥不同作用。能识别双链D NA的特异顺序，并在该顺序内的固定位置上进行切割，产 生特异的DNA片段。II型限制性内切酶的识别位点和切割位点是专一和固定的，对相同的基因片段的切割，总
6、是得到同样核甘酸顺序的小 DNA片段。这些切割后的不同大小的 DNA片段，可以与统一内切酶切割后的来源不同的其他DN A片段实行连接，而构建重组DNA。一一基因工程技术的核心II型限制性内切酶识别的专一核甘酸顺序，最常见的是4 6个碱基对。II型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序（反转重复顺序），具有1800的旋转对称性。识别顺序有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方面读序都是 相同的。这类酶切割DN A可有两种形式。交错切割方式：如:5YAATTC 3，31- CTCGA G- y3G AGCTC*-5*每种酶切割后个产生两个DNA片段，每一个片段个含有一个单链末端， 单链末 端是互补的，
7、可以通过形成“氢键”而黏合。不同来源的两条DNA片段经同一种酶切割后，产生互补的黏性末端，通过选 择合适的DNA链接，可将两条异源性 DNA片段组合在一起。 一一重组DNA 的最基本原理用选择专一性不同而产生相同黏性末端的两种酶切割两条不同的- CTTAAG tEtoR. I |柱 炉钙i0t5T-G AATTC-35 CTTAA又如：i51- CTCGAG- 313、G4GCTC 5 DNA片的JI注 4个加醺蜩的3段,可使重组后的DNA片段不再被原来的酶所切割如：Sal I酶切割后产生的黏性末端3 cagct , X h oI酶切割后产生的黏性TCGAG-313,YACCTCT ,既不被S
8、 al I酶切割,末端 （:两者经连接酶连接产生的序列 也不被Xho I酶切割。在质粒改造上很有用 在同一位置上切割DNW链，产生平头末端。如：TGC3 3n CCGG 5n,蜂IIW5- GG CC - X3n CC GG 5,（二）其他类型内切酶1 .同工酶（B o s c h i zomer）:来源不同的两种II型内切酶，它们识别核甘酸 顺序及切割位点都相同，差别只在于当识别核甘酸序列中有甲基化的核甘酸时 一种内切酶可以切割，而另一种不能。如：H pa II和Msp I识别顺序者B是 5 -CCGG羽,若其中有5 甲基胞喀咤，则只有 Msp酶可切割（GGmCC）。2 .Su bset酶：
9、 识别顺序及切割位点相互有关的酶，互称 Subset酶。如:Sam I酶所识别的6个核甘酸顺序中含有Hpa I I酶识别的4个核甘酸顺序。 所以这两个酶可以相互代替使用，它们所切割的DN A片段可以相互连接。3 .可变酶（特殊的）:识别核甘酸顺序一般都大于 6个，但其中一个或几个核甘酸 时可以变化的。4 .远距离切割酶：识别核甘酸顺序的位置与切割的位点不一致，一般切割位点与指 标核甘酸顺序的位置之间有1 0个左右核甘酸的距离。 与I型内切酶相似，不 过I型内切酶识别位点与切割位点的距离更远一些。（三）甲基化酶（不属于内切酶）使识别顺序中的某个核甘酸发生甲基化，保护DNA不被限制性内切酶切:M5
10、C（5-甲基胞喀噬）大多数以M5CpG的形式存在，即CpG岛中的C最容易 是甲基化的底物，而甲基化又与受之调控的基因的表达程度有关。因此 ，研究C pG岛的甲基化是研究基因调控的一个重要方向。当甲基化酶和限制性内切酶共同使用时，常常可以使有多个识别位点的内切酶只 对其中一个识别位点有切割效果，其他位点因被甲基化酶修饰而不能被切割。5, C P%CGPu_G3 .如：限制性内切酶A v al的识别顺序是心Py可以是任何一种喀呢，pu可以是任何一种喋吟。因此可以有 4种识别顺序。 如果同时使用甲基化酶 Ta q I和甲基化酶HpaH,则A v a I的识别顺序将只是5CC CGAG3o-AGCTC
11、tLtC AGATTTTtl CUbt A，TECH如上图，一个基因片段被 Ava I酶切割时，片段中有三个 Ava I酶识别顺序，该片段被 切割成4个片段。 但若先用Ta q I甲基化酶和H paII甲基化酶作用该片段时，片段中某些核甘酸发生甲基化修饰而不能被切割，再用Ava I酶切割时，只能被切割成两个片段。【一甲基化酶对 DN A的某位点进行甲基化修饰 ，进而抵御内切酶的切割一一构建重组质粒】（四）与 内切酶相关的几个概念1 .酶活性单位及标准反应体系酶活性单位：在一定温度、PH及离子强度下，1h内完全酶解（切割）特定 底物DNA,所需限制内切酶的量。（底物DNA:多用人噬菌体DNA。又
12、是可以用某一种酶在入噬菌体D NA上的切割位点，来推算用这种酶切割这种 DNA寸 所需的活性单位。）标准反应体系：在5 0 （J反应体系及指定温度下，使用特定的缓冲体系，用1个活性单位的限制内切酶，酶解1解底物DNA反应1个小时。（若底物比1四多或少，可参照标准体系比例增加或减少酶用量。但增加酶用量时 ，需注 进不可加量过多一一内切酶中通常含有甘油防冻剂，加入酶量过多 ，其中的甘油 会降低内切酶识别顺序的特异性。 也可通过延长反应时间来保证完全的酶切。） 2.星号活力限制性内切酶在非标准反应条件下，切割一些与特异性识别顺序相类似的顺 序活性（该酶的第二活性）。（产生许多不想得到的片段；内切酶的
13、识别切割能力下降，识别特异性下降。）引起星号活力的因素：过高的甘油含量（ 5%）;低盐离子强度（25 mmol/L）;高PH伯：（8.0）;含有有机溶剂；含有非 Mg二价离子；酶量 过大（酶解1闺底物D NA用的内切酶大于1 00个活性单位）。3 .限制性内切酶底物位点优势效应限制性内切酶对同一 DNRt段切割时，在对其可以识别的位点上表现出不同 的切割速率的现象。4 .限制性内切酶质量有良好的酶活性；不存在任何其他核酸内切酶和外切酶的污染；长时间的酶切反应不发生识别顺序特异性的降低；被某一酶切割后的DNA经重新连接后，仍能被同一酶再次识别并再次切割。 内切酶质量的鉴定：5 0 d反应体系中以
14、等量内切酶分别以 1h和12h（过夜）时间来切割底物D NA,用凝胶电泳检查酶切结果。若不出现条带数目的差别，则内切酶质量好。在T4DNA连接酶作用下，重新连接被内切酶切割后的 DNA片段，再用同一 酶切割，若所产生的DNA片段的大小和数目和第一次切割的结果完全一样，则说明酶的质量好。一一可鉴定是否混有其他内切酶和磷酸脂酶（D NA被内切酶切割后，只有各个片段的3OH和5 P基团完好才能再次连接，连接的D NA仍能提供同一酶的相同切割位点，才会出现上面所说的两个完全相同的结 果。）二、DNA重组常用的其他酶类（一）D NA 聚合酶（DN A pol y m era s e）将一个脱氧三磷酸核甘
15、酸加到引物（primer）的3-OH上，再释放出一个焦 磷酸分子（pp i ）。1 . 大肠杆菌 DNA 聚合酶（E c ol i DNApolym c rase ） 聚合酶 I、II I I i聚合酶I、II主要参与DNA修复，I II主要参与DNA复制。三种都有沿模 板按5令方向合成互补D N A链的活性和按3 5向的外切酶活性。聚合酶I 还有5令向的外切酶活性。5 一 3聚合酶活性：填补 DNA链上的缺口，或参与修复DNA合成过程中切 除RN用|物后留下的空缺部分。3 -5外切酶活性：消除在聚合作用中掺入的错误核甘酸。dANIP dTRIP 心工 Mg451- CGCAICI5T -CG
16、C5 一3外切酶活性：切除受损的DNAB分Mg*5T- CGCATCTAG5， CATCTAG T . dOdP里GCGTAGATt寸- GCGTAGATC -5T 搬照聚合豳IK 1 6 now酶：大肠杆菌DNA聚合酶I（10900O Da）经舒替兰酶（枯草杆菌 蛋白酶）水解获得的76O00Da片段。具有5 3 聚合酶活性和35外切酶活 性。可用于填补 DNA单链末端成为双链。可用于合成c DNA第二链。（若将单核甘酸标记放射性核素，则可是合成的DNA双链上带上放射性核素标记。可用此酶通过切口平移来进行探针的放射性核素标记 【切口平移：切口产生3 羟基和5磷酸基团，DNA延伸合成3 端，5端
17、被 小片段降解缺口位点沿着双链向3 端移动，是在体外向DNA分子引入放射性 标记核甘酸的技术。】当双链DNA分 子的一条链上 产生切口时， E.coli 聚合酶 I就可以将核昔 酸连接到切口 的3 -OH末2 .噬菌体DNA合酶T4 DNA聚合酶，也具有5 -3聚合酶活性和外挪I活性。外切酶活性比大肠杆菌DN4聚合酶外切酶活性强2 00倍。可用于探针的放射性核素标记。3 .噬热水生菌DN A聚合酶从噬热水生菌Th emus a q u a ti c us YT-1菌株中分离得到。耐热其中T a q D NA聚合酶使用最多。7075 C生物活性最高。在7 580c条件下，每个酶蛋白分子每秒可以延
18、长 15 0个核甘酸一一被广泛应用于体外扩 增特异性DNAt段的技术（聚合酶链式反应，PCR（二）RNA合酶能利用DNA乍为模板，催化四种核糖核甘三磷酸（NTP底物合成RNAI I:核仁中，转录r RNA顺序II：细胞质中，转录大多数基因（蛋白质基因和部分核内小 RRANA 因），转录是需要“TATA框（酶开始结合的位置，启动子， 聚合II型转录单位特有的）。III：细胞核质中，转录tRNA 5SrRNAS因等少数几个基因。（核质：由单一密闭环状D NA分子反复回旋卷曲盘绕组成的 松散网状结构。无核膜、核仁）（三）DN A连接酶一一基因工程比用的工具酶T4 DN A连接酶（T 4 DNA li
19、gas e ）M g 2+依赖性酶催化双链DNA具有相邻的3羟基和5磷酸末端单链缺口的修复，以 及具有黏性末端或平端的DN4片段的端端连接的酶。DNA!接既可发生在D NA分子之间，也可发生在分子内部。高浓度的DNA末端有利于分子间连接，低浓度则有利于环状DN A分子的形成。DN4连接酶只能连接双链 DNAW不能连接单链D NA（四）反转录酶（逆转录酶，reve r se tr a n scr i pt a s e）以RNAJ模板指导三磷酸脱氧核甘酸合成互补 DNA（cDNA的酶 需要Mg+、Mn2 +作为辅助因子。1反转果诲S5 CDNA 1反转录诲、也聚合Bl以RNA为模板时，在反转录酶作
20、 用下，先合成单链 DNA（ss DNA。再在反转录酶和DN咪合酶I作 用下，以单链DN,模板合成“发 夹”型的双链DNA（ds DNA）ods eDMA y*VAAA. AVWvMW jF1核酸-sidsDNAVUA.最后在核酸酶S1作用下，切割成 两条单链DNA反转录酶可用来把任何基因的 mRNA反转录成cDNA拷贝，然后可大量扩 增插入载体后的DNA。 可用来标记cDNA作为放射性的分子探针。（五）核糖核甘酸A （R Nase A,ri b nucleas e A）核酸内切酶。 特异的攻击RNA上喀呢残基的3端，切割与相邻核甘酸 形成的磷酸二酯键，产生3-磷酸喀噬核甘酸和以3磷酸愚核甘酸
21、结尾的寡核 甘酸（一类只有2 0个以下碱基的短链核甘酸的总称。寡核甘酸可以很容易地与它们的互补对链接，所以常用作探针确定 DNA或RNA的结构）。高浓度时，可对单链RNA的任何位点进行切割；低浓度时,只切割C和U的位 点。一一检测寡核甘酸片段中是否含有 C和U。有显著的细胞毒性。RNase A可用于检测基因突变：利用R NA探针与突变基因形成 RNA-DNA杂 交体时，突变点处不能产生碱基互补（局部单链）这一特点，用RNase A进行切割， 切割产物可通过跑变性胶得到分离，可用放射自显影等其他方法检查片段数目及 大小,从而推知发生突变的位点。RNA探针可通过将相应的DNA片段克隆至含有S P6
22、或T7启动子的载体中得到。在操作RNA的实验时一定要戴口罩和手套（RNase A存在非常广泛，人 唾液、汗液中均含有），以避免有RNase的污染，所用的容器及蒸储水也都必须 经去RNase处理。【用D E PC处理：0.1?100比例加DEP C ,3 7c 12h,高温5min 除去DE PC残留。含Tr i s的溶液不能用0 . 1%DEPC理（DEPC会和Tri s的氨 基反应而降解，失去灭活 RNase的能力），通常可改用D EP C处理过的水来配 DEPC已配好的可用1%DEPCb理（不过会有DEPC1留）。】（六）核糖核酸酶T1 （RNase T1）核酸内切酶。特异地攻击鸟甘酸 3
23、侧的磷酸基团，切割与其相邻核甘酸的5 磷酯键，产生3-磷酸鸟音和以3磷酸鸟喋吟核甘酸结尾的寡核甘酸。主要用于RNA测序和指纹图谱分析/也可和RNase合用，以除去样品中RN A;除去DN A-RNA杂交体中杂交体的 RNA区。（七）核糖核酸酶 H（RNa s e H）核酸内切酶。 水解RNA DN A杂交体中的 RNA链,产生5-磷酸寡核 甘酸和5磷酸核糖核甘。J使RNA被切割后成为DNA聚合酶合成第二条cD NA的引物，形成cDN A。（八）脱氧核糖核酸酶 I （ DNase I,de oxyribo n u c 1 ea se I）核酸内切酶。M g 2+条件下,随机切割单、双链DNA,产
24、生5磷酸末端的单脱氧核甘酸和 寡脱氧核甘酸。Mn2+存在下能将双链DNA同时切断，是DNA片段化。其活性依赖于Ca2+ （辅因子），活化剂：Mg2+,抑制剂:螯合剂（EDTA等）DNas e污染：用具要高温处理，样品中加 EDTA,抑制酶活性；或冰水中灭 活。、用途：除去RNA样品中污染的基因组 DNA;转录反应后DNA模板的降 解。（九）核酸酶 S1（nuclease S1）内切酶（高度单链特异）。酶解单链D NA、单链RNA,产生5-磷酸的单核 甘酸或寡核甘酸。对双链 DNA、双链RN A和DN A-RNA杂交体相对不敏感。需要低水平的Z n 2 +激活，PH4. 04. 3抑制剂:螯合剂
25、（EDT A、柠檬酸等卜 磷酸缓冲液、和0.6%左右的SDS溶液。S1核酸酶的水解功能可以作用于双链核酸分子的单链区，并从单恋部分切 断核酸分子，且这种单链区可以小刀只有一个碱基对的程度。一一去除 DNA片 段中突出的单链末端；切开合成 d s DNA时形成的“发火”结构。（十）核酸酶Bal 31水解超螺旋DN A成开环状，进而成为线状DNA。有外切酶活性，在Mg2+、C a2+参与下，能从DN A双链两端连续向中间切割水可用于DNA链的限制性内切酶切割位点分析（绘制DNA限制图谱）；缩短 D NA片段。（H一）核酸外切酶（exonu c lease）是具有从DNA分子链的末端顺次水解磷酸二酯
26、键而生成单核甘酸作用的两种：水解磷酸二酯键的5端生成3-单核甘酸的酶；水解磷酸二酯 键的3端生成5-单核甘酸的酶（大肠杆菌核酸外切酶 I、II和I I I）。核酸外切酶II I :从双链DNA3 O H逐一降解切除5单核甘酸。不降解单链DW或3突出的双链DNA具有多种酶活性：对无喋吟DNA特异的 核酸内切酶活性、3磷酸酶活性、3外切酶活性、RNase H活性。核酸外切酶III与核酸酶S1合用可使克隆的DN砌子产生缺失（del ec t ion , DNA链上一个或一段核甘酸的消失）【核酸外切酶III与底物的每次结合，只切除最末的几个核甘酸，从而使双链DNA产生渐进缺失。最适底物 ：平末端 或3
27、凹陷末端DNA 3 突出末端抵抗该酶的切割，抗拒程度岁 3突出末 端的长度而改变（4碱基完全不能被切割）。对于一端是抗性位点（3突出端），一端是敏感位点（5 突出端或平末端）的线性D NA分子，可以产生单向 缺失。Eg：将双链DN4用产生不同末端的限制性内切酶双酶切后，利用Exo II I的3 一5酌外切酶活性，从一端降解，得到互补的单链DNA和5-单核甘酸。与B al 3 1 Nuc 1 eas e相比,碱基特异性小，如在富含GC的位置上，由于反应停 止的机率较低，可用于DNA的Dclecti on制作。】（十二）多核甘酸激酶（po 1 ynucleot i de k in a se）催化磷
28、酸基从ATP转移到DNA、RNA、寡核甘酸等分子的5-羟基末端。 用途:对缺乏5-磷酸的DNA或合成接头磷酸化； 对5 OH末端进行同位素标t己。炉询-ATP5T HOy 5 J2POH y31 HO OH 5HO 羽 5多核甘酸激诲标记底物为/2PAT P。一般天然存在的核酸不存有5-羟基而有5-磷酰基,标记时，应先用碱性磷酸酯酶将5-磷酰基除去（脱磷）。（十三）碱性磷酸酯酶（al kalin e phosphatase）除去DNA、RNA的5-磷酰基，防止片段间彼此连接（自身环化）。标记（5）前除去DNA或RNA的5-磷酰基。（十四）末端转移酶（TdT, term inal deoxy nuc 1 eotid e trans f erase） 一种不需要引物就能将脱氧核甘三磷酸（d NTP）加到某DNA片段上3-OH 上的酶。可进行DNA3 末端加尾和标记。GM 3,e-TfOnTJy