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1、人脐带间充质干细胞操作标准一、人脐带间充质干细胞的别离和培养1 .准备45个培养皿,翻开放在超净台中,将消毒过的平剪X1,弯剪X2,有齿银子x 4,放入超净台,紫外照射 30 min ,通风10 min;2 .在1#、3#和4#培养皿倒入25 ml生理盐水,在2#养皿倒入25 ml酒精;3.将盛放脐带的器皿用酒精消毒外外表后放入超净台,用弯嘴钳取出脐带放入1#培养皿,清洗残留血渍,用第2把弯嘴钳配合挤出脐带血管内的积血；4.将脐带 转移至2#养皿,完全浸泡,计时1 min;5 .将脐带转移至3#培养皿,用平剪剪成3 cm左右的小段,清洗脐带内的积血 如果积血较多,可再次转入另一加盐水的培养皿
2、;6 .用有齿银子别离2根动脉和1根静脉,剥离华尔通氏胶,放入 4#培养皿；7. 将剥离的胶体转移至50 ml离心管中,2000 rpm离心5 min; 8. 弃上清液,将胶 体倒入干净的培养皿中,用小剪刀将其剪成糊状并转移至50 ml离心管中；9 .以0.5 ml/瓶的量将胶体组织块接种至 T75培养瓶,每瓶参加4 ml脐带有 血清培养液DMEM/F12 + 10% FBS + 1% L-Glutamine + 1% MEM NEAA + 10 ng/mlbFGF,水平摇晃培养瓶使组织块分布均匀；10 .第2天观察是否有污染,每3天换一次液,并观察细胞爬出情况过程中 须注意平稳地拿放培养瓶,
3、防止组织块发生移动 ;11 .培养14天左右,倒去上清培养液,加生理盐水3 ml/瓶洗涤,用0.25% 胰酶2 ml/瓶消化下爬出细胞及组织块,并用上清培养液 1 ml/瓶终止消化；12 .收集细胞及组织块悬液,2000 rpm离心5 min;13 .弃上清液,参加适量生理盐水混匀,用 70滤网过滤去除组织块,即得到P0代脐带间充质干细胞；614.细胞计数,按10/瓶接种,每瓶参加10 ml脐带无血清培养液 (UltraCULTURE + 2% Ultroser G + 1% Glutamine + 1% MEM NAA),每 3 天换一次 液；15.细胞融合率到达80流右时,加胰酶消化,按1
4、: 3传代.二、细胞传代1 .观察细胞融合率在80%Z上时,进行传代；2 .将培养瓶依此排好,取1020瓶放入超净台,同时进行操作；3.依次倒去 上清液(预留1020 ml作终止液),每瓶参加3 ml生理盐水,洗涤细胞后弃去；4 .每瓶参加2 ml胰酶,消化23 min,镜下观察,待细胞收缩变圆,参加 1 ml终止液终止消化；5 .轻轻拍打培养瓶底面,收集消化液,再用 10 ml生理盐水逐瓶洗涤,并收 集洗涤液,混合消化液和洗涤液,2000 rpm离心5 min;66.弃上清液,参加适量脐带无血清培养液重悬细胞,按10/瓶接种,每瓶培养液终体积为10 ml o三、细胞冻存1.预先配置细胞冻存液
5、(FBS + 10% DMSO)取50 ml离心管,参加FBS然后 逐滴参加DMSO摇匀,放入4?C培养箱冷藏；72.将消化得到的细胞悬液2000 rpm离心5 min ,按10/ml密度重悬于细胞冻存液,分装入冻存管,每管装量不超 过 1 ml；3.将冻存管置入预先放置室温下的梯度降温盒后,放入 -80?C冰箱；4. 24 h 后,将冻存管放入冻存盒内,继续于-80?C冰箱内保存,或转移至液氮罐中,长期 储存；5.梯度降温盒每使用5次更换一次异丙醇,每次加液量为 250 ml.四、细胞复苏1 .取冻存细胞,置于37?C水浴至根本融化,用酒精消毒冻存管管壁和管口,放入超净台；2 .将冻存液转移
6、至50 ml离心管,逐滴参加2030 ml生理盐水并摇匀,2000 rpm 离心 5 min;3 .弃上清液,参加 30 ml生理盐水,重悬细胞,2000 rpm离心5 min;64.弃上清液,参加适量脐带无血清培养液重悬细胞,按10/瓶接种,每瓶培养液终体积为10 ml o五、细胞出库1 .复苏或消化得到的细胞在出库前需用生理盐水洗涤3遍,每次洗涤2000rpm 离心 5 min;2 .参加适量含10以血清白蛋白的生理盐水,重悬细胞；3 .按规格要求分装细胞,粘贴标签并做好记录；4 .如需运输,建议用泡沫盒加假设干冰袋包装出库 ；5 .冻存细胞如需出库,必须在泡沫盒内放入适量干冰,将冻存管置于干冰内部,装箱出库