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1、课题5制备和应用固定化酶,1,课题5 制备和应用固定化酶,课题5制备和应用固定化酶,2,1.直接应用酶生产的缺点。2.固定化酶的概念及优点。3.固定化酶的方法。4.固定化酶多采用的方法及原因。5.固定化细胞的优点和缺点。6.固定化细胞常用的方法及原因。7.活化酵母细胞的含义及注意事项。8.配制CaCl2溶液的注意事项。9.配制海藻酸钠溶液的加热方法及海藻酸钠浓度过高和过低造成的后果。10.海藻酸钠溶液与酵母细胞混合的注意事项。,课题5制备和应用固定化酶,3,思考：直接应用酶生产的缺点？,一、固定化酶技术,酶的稳定性差，通常在强酸、强碱、高温和重金属离子等因素的影响下容易失活； 溶液中的酶很难回
2、收,不能被再次利用,提高了生产成本; 反应后酶会混在产物中,可能影响产品质量。,(一)固定化酶技术产生背景：,课题5制备和应用固定化酶,4,2、固定化酶技术的优点：,将酶固定在不溶于水的载体上,使酶既能与反应物接触,又能与产物分离, 可以被反复利用。,微生物产生的酶，可以分为分泌在细胞外的胞外酶和包含在细胞内的胞内酶。利用胞内酶时，需要采用手段将细胞破碎后，将酶进行分离纯化，提取后酶的活性和稳定性往往都受到很大的影响。,(二)固定化酶技术,1、固定化酶概念：,课题5制备和应用固定化酶,5,3、固定化酶应用实例：,应用固定化酶技术生产高果糖浆,生产原料:葡萄糖,生产机理：经葡萄糖异构酶的异构作用
3、，将一部分葡萄糖转化成果糖，由葡萄糖和果糖而组成的一种混合糖糖浆。,高果糖浆是指果糖含量为42%左右的糖浆。,课题5制备和应用固定化酶,6,使用固定化酶技术，将葡萄糖异构酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应液却可以自由出入。生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触转化成果糖，从反应柱的下端流出。,生产过程,课题5制备和应用固定化酶,7,生产优点,反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。,课题5制备和应用固定化酶,8,4、固定酶
4、(或细胞)的方法：,包括包埋法、化学结合法(将酶分子或细胞相互结合，或将其结合到载体上)和物理吸附法。,(1)包埋法,定义：将酶或细胞包埋在不溶于水的多孔性载体中，包埋成格子型或包埋成微胶囊型。,载体：明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺。,课题5制备和应用固定化酶,9,交联法：通过双功能试剂，将酶和酶联结成网状结构的方法。,(2)化学结合法,定义：将酶分子或细胞相互结合，或将其结合到纤维素、琼脂糖，离子交换树脂等载体上的固定方式。,种类,共价结合法：酶和载体以共价键的形式结合在一起的方法，这种方法需要酶和载体都具有氨基、羧基或羟基等官能团。,课题5制备和应用固定化酶,10,(3)物
5、理吸附法：将酶吸附到固体吸附剂表面的方法，固体吸附剂多为活性碳、多孔玻璃等。,说明：酶和细胞固定方法的选择:,(1)方法：酶更适合采用化学结合和物理吸附法固定化细胞多采用包埋法固定化,(2)原因：细胞个大，酶分子很小；个体大的细胞难以被吸附或结合，而个小的酶容易从包埋的材料中漏出。,课题5制备和应用固定化酶,11,酶的几种固定方式,将酶吸附在载体表面上（物理吸附法）,将酶相互连接起来（化学结合法）,将酶包埋在细微网格里（包埋法）,课题5制备和应用固定化酶,12,课题5制备和应用固定化酶,13,二、固定化细胞技术 1、优点和缺点：,将合成酶的细胞直接固定。与固定化酶技术相比,固定化细胞制备的成本
6、更低、周期短、产量大、操作更容易，固定一系列酶，対酶活性影响更小。,将微生物细胞限制或定位于特定空间位置，即将微生物制成固定化细胞后，能避免复杂的细胞破碎、酶的提取和纯化过程，因而固定化细胞内酶的活性基本没有损失。固定后的微生物细胞可以作为固体催化剂催化一系列反应，同时，催化反应结束后又能被回收和重复利用。,课题5制备和应用固定化酶,14,固定化细胞操作容易、对酶活性的影响更小、可以催化一系列的反应、容易回收等，但由于大分子物质难以自由通过细胞膜，因此固定化细胞的应用也受到限制。,思考：根据所学课本内容想一想，固定化酶技术和固定化细胞技术这两种技术中哪种技术先发展起来的？,课题5制备和应用固定
7、化酶,15,2、固定化细胞的方法： 吸附法和包埋法。 常用的方法是包埋法。,原因：细胞个大，酶分子很小；个体大的细胞难以被吸附或结合，而个小的酶容易从包埋的材料中漏出。,课题5制备和应用固定化酶,16,三、酵母细胞的固定化技术,选用海藻酸钠作载体包埋酵母细胞,1、酵母细胞的活化, 过程：称取1g干酵母，放入50ml的小烧杯中，加入蒸馏水10ml。用玻璃棒搅拌，使酵母细胞混合均匀，成糊状，放置1h左右，使其活化,活化：在缺水状态下，微生物处于休眠状态。活化就是让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态。,课题5制备和应用固定化酶,17,课题5制备和应用固定化酶,18,酵母细胞所需要的活化时间较
8、短，一般需要0.51 h，需要提前做好准备。此外，酵母细胞活化时体积会变大，因此活化前应该选择体积足够大的容器，以避免酵母细胞的活化液溢出容器外。,注意事项,课题5制备和应用固定化酶,19,2、配制物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液, 过程：称取无水CaCl2 0.83g，放入200ml的烧杯中，加入150ml的蒸馏水，使其充分溶解，待用。,注意事项：溶解物质要彻底，勿用自来水溶解，以防自来水中各种离子影响实验结果。,课题5制备和应用固定化酶,20,3、配制海藻酸钠溶液, 过程：称取0.7g海藻酸钠，放入50ml小烧杯中，加入10ml水，用酒精灯加热，边加热边搅拌，将海藻酸钠调成
9、糊状，直至完全溶化，用蒸馏水定容至10ml。,这是实验中最重要的一环，是实验成败的关键。,课题5制备和应用固定化酶,21,注意事项,加热时要用( )，或者( )，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止。,小火,间断加热,海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少。,课题5制备和应用固定化酶,22,4、海藻酸钠溶液和酵母细胞混合, 过程:将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入以活化的酵母细胞，进行充分搅拌，再转移至注射器中,课题5制备和应用固定化酶,23,注意事项,A、溶化好的海藻酸钠溶液必须冷却至室温，否则会因温度过
10、高杀死酵母菌。,B、搅拌要彻底充分，使两者混合均匀，以免影响实验结果的观察。,课题5制备和应用固定化酶,24,5、固定化酵母细胞, 过程：以恒定的速度缓慢的将注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中，将形成的凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右。, CaCl2溶液作用,海藻酸钠胶体在CaCl2这种电解质的作用下，发生聚沉，形成凝胶珠，需稳定30min左右。,课题5制备和应用固定化酶,25,6、用固定化酵母细胞发酵,将固定化酵母细胞（凝胶珠）用蒸馏水冲洗23次，洗去凝胶珠表面多余的电解质溶液。,过程,见课本“发酵麦芽汁”思考：在发酵时，麦芽汁的浓度不能太高，为什么？浓度太高会使酵母细胞
11、因失水过多而死亡。,课题5制备和应用固定化酶,26,(一)观察凝胶珠的颜色和形状 如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。(二)观察发酵的葡萄糖溶液 利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味,四、课题成果评价,课题5制备和应用固定化酶,27,巩固练习,1、酶固定化技术与细胞固定化技术的关系是A 酶固定化技术是细胞固定化技术的基础B 细胞固定化技术是酶固定化技术的基础C 酶固定化技术与细胞固定化技术是同时发展起来的D 固定化细胞技术先于酶固定
12、化技术,课题5制备和应用固定化酶,28,2、固定化酶技术常采用A 包埋法 B 化学结合和物理吸附法C 活化法 D 微囊化法3、海藻酸钠在水中溶解的速度较慢，需要经过加热促进其溶解，采用的最好加热方法是A 快速加热 B 持续高温加热C 小火间断加热 D 灼烧加热,课题5制备和应用固定化酶,29,4、酵母菌的活化是指A 让酵母细胞恢复运动状态B 让酵母细胞在缺水状态下更容易休眠C 让酵母细胞内酶活性加倍D 让处于休眠状态的酵母细胞重新恢复正常的生活状态,课题5制备和应用固定化酶,30,5、细胞固定化技术与酶固定化技术相比，所具备的特点是A 成本更低、操作更容易、不能连续性生产B 成本更高、操作更难、不能连续性生产C 成本更低、操作更容易、能连续性生产D 成本更低、操作更难、能连续性生产,