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1、实时荧光定量 PCR(Quantitative Real-time PCR )数据处理相对定量4 CT和2- CT方法一、实时荧光原理及其中的概念实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)作为分子生物学实验中强 大快速的一种检测手段，已经被广泛应用于临床和普通实验室。废话不多说，简 单介绍一下其原理，和两个基本概念 Ct (Cycle threshold )和扩增效率，然后详 细解释一下相对基因定量的方法。实时定量PC做术：利用荧光信号的变化实时检测 PCR扩增反应中每一个循 环扩增产物量的变化，通过 Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。 qPCR中
2、常用的荧光染料为 SYBR Green I,加入过量SYB茨光染料，SYBR光染 料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYB磔料分子不 会发射任何荧光信号，因此在 PCR每个循环的延伸(双链图2)过程中检测荧光信 号，可以绘制原始的扩增曲线。如下图1:图1： PCRT增曲线图2 :双链发射荧光Rn荧光信号量，n为循环数扩增曲线可以分为：图31 .基线期：-荧光信号在最初的数个循环里变化不大， 接近一条直线，称为基2 .对数期：-继基线之后，扩增进入到指数增长期，像细菌的繁殖曲线3 .平台期：-随着扩增的循环增加，引物,dNTP的消耗殆尽，不会再有新的DNA链产生了，就进入
3、到平台期了图3扩增曲线的分期01020304050Cycle实时荧光PCR重要的概念：CT、扩增效率CT直(Cycle threshold value ):实时荧光PCRt程中，扩增产物的荧光信号达到 设定阈值时所经过的扩增循环数。 起始模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数 越少，即Ct值越小。Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。扩增效率E (efficiency ):理想的PCRS应在指数期应该是 Rn=R* 2 ( Rn, n次循环产物量。R,初始模板量。n,循环次数) 因为每扩增一次 PCR产物就会变为 上次的2倍。但是在实际PCRT增中E基本在0.65-0.9 。因此每个PC皈应的
4、效 率不一定都相同。因此，扩增公式可以写成：Rn= R* (1+日n二、2- CT数据处理的方法基因定量包括绝对定量和相对定量。绝对定量就是标准曲线法，这里不详细介绍，可以问度娘。绝对定量法比较费时费力，除了特殊情况，相对定量的方法 也可以达到实验目的。在相对基因定量方法中，目前被广泛采用的就是2-A ACT法。用此方法有个前提，即目的基因(interest gene)和内参基因(endogenous control )有相同相近的扩增效率E。扩增效率的推算:1.公式法n Rn= R0* (1+E)对两边取对数：lgRn = lg (1+ E)? n +lgR 0n=CT时候 f (DlgRc
5、t = lg (1+ E)? CT +lgR 0由可知lgRn 为Y轴n为X轴作图可以看到lg (1+ E)即公式。的斜率S。因此得到E = 10 s-1由公式可知到达阈值时产物是一定定值的（阈值的定义） IgRct = lg (1+ E) ? CT +lgR0所以：IgRo是和CT成正比的，这也是可以根据 CT值判断初始模板量的原理2.观察法观察目的基因和内参基因的扩增曲线，如果指数期的曲线形状一致，可以认为两个基因的扩增效率类似。这对于做很多基因的扫描绘制基因热图很实用也很简单，省去了每个基因的扩增效率的确定。如下图 4图4基因的对数期扩增曲线形状一致10001.000 E-11.000
6、E-1 -01.000 E-21.000 E-3上面的作为理解实时荧光PCR勺基础，下面说一下具体试验中的应用三、2- CT方法实用举例例一用药物处理肺癌细胞，计算处理对UTF-1 mRNA勺影响。药物处理和未处理样品CT值分别23.5 , 28.3。药物处理和未处理样品内参基因(3 -action的CT分别为19.5, 21.3处理组 ACT =23.5-19.5=4未处理组4 CT=28.3-21.3=7 CT=处理组 CT-未处理组4 CT=4 - 7= -32-ct=2-(-3) =8号药物处理UTF-1基因表达变化倍数=2处理UTF-1CT-内参CTH未处理UTF-1CT-内参CT-
7、23.5-19.5-28.3-21.3=2V- (-3)=2.=8因此可以理解为药物处理使UTF-1的表达是未处理的8倍如果2-ZCT计算下来是2一3,那么可以解释为处理的是未处理的1/8,或者说处理后目的基因表达下降8倍例二如果5例HER2(+)组和5歹IHER2 (一)组Bcl-2基因和B -action 的CT值已被测定如何评价HER2(+)组Bcl-2的表达是HER2(-)组的多少倍？因为不知道阳性组5例对应阴性组5例作CT,所以要用到：2-A。,转换数据CT Bcl-2CT faction CT2-ACT18.312.362-6HER2 ( + )组17.513.542-419.31
8、2.372-723.314.392-9HER2(-)组22.512.5102-1024.615.692-9用mean sd表示2-ACT_2-CTbcl-2-CT faction计算 HER2 (+)组2-mt的均值为44X2-9HER2 (-)组 24CT 的均值为 2.5X2-9因此HER2 (+)组BCL-2的表达是 HER2 (-)组的44/2.5=17.6倍 四、存在的问题1 .如果目的基因和内参基因的扩增效率不一致，怎么解决？一般的解决方案是优化PCRM牛，重新设计引物，PC神系添加氯化镁等等来获得相同的扩增效率。 在这里可以告诉大家，即使扩增效率不一致，我们可以用另外的一种分析方
9、法见 参考文献1。2 .内参基因是否受到处理因素的影响呢，如何选择一个合适的内参基因？可 以参考2刚接触实时荧光PCR不久，可能对其理解有限，本文中会存在一些错误与不足，希望大家指正。主要文献是下面两篇，其他的就没附上，如果对你有帮助就点个赞吧！1 .Quantitative real-time RT-PCR data analysis: current concepts andthe novel “ gene expression s CT difference ” formula2 Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method，