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1、导向性IFNa2aaMSH基因的克隆、表达、纯化及鉴定【关键词】干扰素a 2a； a促黑素；大肠杆菌；基因表达； pET 22b (+)载体IFN a 2a是一种具有抗肿瘤活性的细胞因子，己被FDA批 准用于多种恶性肿瘤的医治，但因其在临床医治中需大剂量长期给药 且常会引发明显的毒副作用，使其应用受到必然的限制.a MSH是 一种由多种细胞分泌的含13肽的激素，也是一种天然存在的多肽，目 前的研究证明其可通过免疫调剂作用抑制恶性黑色素瘤细胞的黏附、 侵袭和转移卜2 . Froidevanx等3研究说明所有黑素细胞和黑 素瘤细胞都表达a MSH受体MC 1R,且黑素瘤细胞表达MC1R上调, 人黑
2、素瘤细胞表面MC1R密度为9005700结合位点/细胞，而正常状态 下人表皮黑素细胞上MC1R不超过100个结合位点/细胞.咱们利用基 因重组技术，构建导向性IFN a 2a a MSH融合基因表达载体， 并诱导其在大肠杆菌中表达，旨在为恶性黑色素瘤的靶向性医治提供 基础资料.1材料和方式材料质粒 pET 22b （+）、菌种 DH5 a 及 Rosetta gamiTM2 （DE3）, 药学系生物技术中心保留；各类限制性内切酶，T4DNA连接酶和DNA Marker DL2000 （TaKaRa公司）；片段合成与序列测定由上海英骏生物 技术完成；DNA凝胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒（Omeg
3、a公司）；低 Mr蛋白标准（MBI公司）；鼠抗人干扰素a （Santa Cruz公司）；羊抗 鼠IgG Ap （华丽工程公司）：显色剂（美国Promega公司）；蛋白月东、 酵母粉、低熔点琼脂糖（Spanish公司）；异丙基硫代B D 半乳 糖甘（IPTG,华丽生物工程公司）；其他试剂均为国产分析纯.方式融合基因的克隆依照大肠杆菌惯用密码子设计并合成了编码aMSH导向肽的核甘酸片段：片段 1 （48 nt）： 5 GAT CCTCCT ACT CCA TGG AAC ACT TCC GTT GGG GTA AAC CGG TTT AGG 3 ；片段 2 （48 nt）： 5 TCG ACC T
4、AA ACC GGT TTA CCC CAA CGG AAG TGT TCC ATG GAG TAG GAG 3 .这两个片段退火后可形成aMSH导向肽的核甘酸片段和5端和3端的粘性结尾（BamH I和Sall的酶切位点）；将合成的 两个片段煮沸变性10 min后退火，再与用BamHI和Sall双酶切处置 过的pET 22b （ + ） IFX a 2aNGR质粒连接，连接产物转化感受态细胞DH5a,培育挑选阳性克隆（图1）.重组质粒的酶切和测序从抗生素琼脂培育平板中挑取mAb抗性菌落，于LB培育基中 培育留宿，提取质粒DNA,用限制性内切酶de I和Neo I进行双酶切 鉴定及核酸序列分析.
5、将测序正确者命名为pET 22b ( + ) IFN a 2a a MSH.重组蛋白的诱导表达重组质粒pET 22b (+) IFN a 2a a MSH转化感受态 细胞Rosetta gamiTM2 (DE3),挑取mAb接种于含氨茉青霉素(50 mg/L) 四环素(25 mg/L)链霉素(10 mg/L)及氯霉素(35 mg/L) 的LB培育基中，第二天早晨按1 ： 100的比例接种于上述一样条件的 LB培育基中，37培育至A600 nm=时加入IPTG至终浓度为1 mmol/L 诱导表达，37振荡培育4h,离心搜集菌体，行SDS PAGE鉴定.的初步纯化和Western Blot鉴定超声
6、裂菌重组蛋白IFXa2aaMSH是以包涵体的形式存在，取5 g表达湿菌，将 其悬浮于 35 mL STE(100 mmol/L NaCl, 50 mmol/L , PH , 1 mmol/L EDTA)中，在冰浴中300 W超声裂菌，超声5 s,间歇10 s,全程20 min, 4, 10 000 g离心20 min,保留上清，行SDS PAGE鉴定，并与溶 菌酶裂菌结果进行比较.疏水作用层析初步纯化重组蛋白层析柱为 Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub)；缓冲液 A： 25 mmol/L , 1 mmol/LEDTA, 1 mol/L (NH4) 2S
7、04, pH ； 缓冲液B: 25 mmol/L , 1 mmol/L EDTA, pH ；将超声裂菌上清在冰浴 中进行硫酸筱沉淀，硫酸铉的终浓度为400 g/L, 4, 10 000 g离心 20 min,保留沉淀，用约20倍体积的A液溶解沉淀，4, 10 000 g 离心20 min,保留上清备用.层析柱以缓冲液A平稳至基线稳固，上 样后继续以缓冲液A冲洗至基线稳固，线性梯度洗脱100% A至100% B, 洗脱体积为约25个柱床体积，流速为3mL/min.Blot于SDSPAGE终止后拆下凝胶，将蛋白转移至硝酸纤维 素膜上，用鼠抗人IFN a mAb (1 ： 100),行Western
8、 Blot鉴定.蛋白质含量及活性测定将WISH细胞在含抗生素、谷氨酰胺和100 g/L FCS (pH ) 的Eagle s培育液中37培育留宿.待细胞呈单层生长后弃培育 液,并用胰酶消化细胞.将消化的WISH细胞按1000个细胞/孔接种于 96孔板.37孵箱培育留宿.换为含50 g/L FCS的Eagle s液稀 释的不同浓度的待测样品，继续培育，第二天换用含50 g/L FCS的 Eagle s培育液按1 ： 1030稀释的VSV病毒培育液,37培育24h, 观看结果，以50%细胞爱惜的待测样品稀释度为其效价. 2结果a 2a a MSH的酶切鉴定用限制性内切酶Nde I和Neo I对重组
9、质粒pET22b (+)IFX a 2a a MSH进行双酶切，可见一约530 bp片段，与预期大 小一致，证明目的片段己插入pET 22b(+)载体中(图2).测序结 果与合成的a MSH基因序列比对完全一致.a 2a a MSH在大肠杆菌中的诱导表达SDSPAGE电泳结果说明，含有pET 22b (+) IFN a 2aa MSH 的工程菌 Rosetta garniTM2 (DE3)经 1 mmol/L IPTG 诱导后 在约20 ku处产生了一条新生蛋白条带，与预期结果相符合；而未诱 导的那么无相应蛋白条带显现(图3).超声裂菌及溶菌酶裂菌经溶菌酶裂菌证明重组蛋白IFNa2aaMSH是
10、以包涵体的形 式存在，采纳超声裂菌的方式裂解菌体细胞，发此刻裂菌上清中显现 IFN a 2a a MSH目的蛋白条带（图4）.a 2a a MSH的纯化和Western Blot鉴定采纳疏水作用层析进行重组蛋白的初步纯化，可取得较高纯 度的IFN a 2a a MSH （图5）,纯化产物的Western blot鉴 定（图6）.a 2a a MSH重组蛋白含量及活性的检测溶菌酶裂菌上清的蛋白活性、蛋白含量及比活性别离为义108 U/L, g/L和X 108 U/g.超声裂菌上清的蛋白活性、蛋白含量及比活 性别离为 4X1011 U/L, g/L 和X 1010 U/g.3讨论目前绝大多数的临床
11、药物都存在一个不容轻忽的缺点，即缺 乏对病理部位的特异亲和力.大剂量给药不仅使得药物本钱提高，还 不可幸免地产生非特异性毒性，对正常组织造成严峻损伤，引发毒副 作用.为了克服这一难题，人们提出了导向性的医治策略，咱们实验 室曾前后进行了 NGR导向性肿瘤医治药物的研发，如IFX a 2a NGR, tum5 NGR 4-5.IFN是第一个应用于临床的基因工程产品，但在实体瘤的医 治中，注射入体内的IFN很少能达到肿瘤部位，因此医治成效较差 1-2, a MSH可与黑素瘤细胞表面的MC1R特异性结合，增进恶性 黑色素瘤细胞的凋亡，而且通过皮肤基底膜的重建而抑制皮肤黑素瘤 的转移.Murata等6
12、证明a MSH在体内外都可通过皮肤基底膜 的重建抑制鼠B16细胞的侵袭.李蠡等7研究发觉a MSH可明显 上调恶性黑色素瘤细胞Fas/FasL的表达，增进恶性黑色素瘤细胞的凋 亡.为了提高IFN a 2a对肿瘤组织的选择性，咱们通过基因工 程技术构建了融合表达载体pET 22b (+) IFN a 2a a MSH, 并成功地在大肠杆菌中表达了融合蛋白IFN a 2a a MSH,预期 此种融合蛋白既具有与黑色素瘤特异性结合的能力，又具有IFN a 2a抗肿瘤活性，能提高医治作用，减低毒副反映.关于以包涵体形式存在的融合蛋白，由于包涵体结构的特殊 性，在用表面活性剂和变性剂处置、溶解包涵体时，
13、会引发重组蛋白 的变性.咱们通过简单的超声裂菌使重组蛋白以可溶解的形式存在， 幸免了包涵体洗涤和蛋白复性的进程，大大缩减了实验的进程，同时 采纳硫酸铁沉淀的方式，通过疏水作用层析一步分离取得较高纯度的 目的蛋白，可为尔后关于以包涵体形式存在的融合蛋白的纯化提供一 个新的方式.【参考文献】1 Zhu N, Laila R, Eves P, et al. Melanoma cell migration is up regulated by tumour necrosis factor alpha and suppressed by alpha melanocyte stimulating horm
14、one J . Br J Cancer, 2004,90(7):1457-1463.2 Eves P, Haycock J, Layton C, et al. Anti inflammatory and anti invasive effects of alpha melanocyte stimulating hormone in human melanoma cell J . Br J Cancer, 2003,89(10) : 2004-2021.3 Froidevanx S, Calame Christe M, Tanner H, et al.A novel DOTA alpha mel
15、anocyte stimulating hormone analog for metastatic melanoma diagnosis J . J Nucl Med, 2002,43(12) : 1699-1706.4刘磊，孟洁如，赵宁，等.融合蛋白IFN a 2a NGR在荷瘤小鼠体内的肿瘤局部散布和组织定位J.第四军医大学学报, 2004,25 (15) :1400-1402.5 Jieru M, Nan M, Zhen Y, et al. NGR enhanced the anti angiogenic activity of turn 5 J . J Biochem, 2006, 1
16、40(2) : 1-6.6 Murata J, Ayukawa K, Ogasawara M, et al. Alpha melanocyte stimulating hormone blocks invasion of reconstituted basement membrane (Matrigel) by murine B16 melanoma cells J . Invasion Metastasis, 1997, 17:8293.7李盆，刑新，薛春雨，等.a 黑素细胞刺激素对恶性 黑色素瘤细胞Fas/FasL表达的阻碍及其与凋亡的关系J.临床肿瘤 学杂志,2005, 10 (3)： 230-234.